免疫熒光法和免疫酶標(biāo)法檢測(cè)新城疫病毒的研究.pdf

1、新城疫病毒（NDV）又稱(chēng)亞洲雞瘟病毒，該病毒可引起雞、火雞、鴕鳥(niǎo)、鴿子、孔雀及其它野鳥(niǎo)等多種禽類(lèi)發(fā)病。該病1926年首次發(fā)現(xiàn)于英國(guó)新城，現(xiàn)流行于世界各國(guó)。在最近70年間，新城疫病毒流行造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失，打擊了許多國(guó)家的養(yǎng)禽業(yè)。國(guó)際獸疫局把新城疫定為必須通報(bào)的傳染病。盡管常規(guī)檢測(cè)新城疫病毒及其抗原的方法很多，但是檢測(cè)診斷新城疫活病毒在病毒學(xué)研究方面仍具有重要意義方法。為此建立了免疫熒光法和免疫組化法兩種血清學(xué)方法分別測(cè)定NDV在CEF

2、和COS-7兩種細(xì)胞中的定位，通過(guò)這兩個(gè)方法不僅能快速、準(zhǔn)確的檢查NDV，而且還能夠得到新城疫活病毒在細(xì)胞中的增殖和定位情況，為研究NDV的致病性提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 通過(guò)高速離心和超速離心的方法對(duì)NDV進(jìn)行純化，經(jīng)過(guò)檢測(cè)，純化的病毒可以用來(lái)進(jìn)行免疫。雞胚尿囊腔接種方法接種NDV F48E9強(qiáng)毒于9日齡的SPF雞胚，每枚接種0.2ml，去除24h內(nèi)死亡的雞胚，取24～120h死亡的雞胚，4℃放置12h，收集其尿囊液，用血凝

3、實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，得到效價(jià)為1：26，-20℃保存；反復(fù)凍融3次，4℃12000r/min離心50 min，收集上清液。將上清液以4℃60000 r/min離心6h，棄上清，用少量0.01mol/L pH7.4 PBS懸浮沉淀，-70℃保存。超離病毒用血凝實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定，得到效價(jià)為28。用所得的病毒免疫兩只青年公雞，得到雞抗NDV多克隆抗體，用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)，效價(jià)分別為1：27和1：28。
　　 采用飽和硫酸銨鹽析、透析、Sepha

4、dex G-200柱凝膠層析法從雞血清中獲得IgG，經(jīng)SDS-PAGE電泳和免疫電泳鑒定，純化后的IgG達(dá)到電泳純，可以用來(lái)免疫。Folin-酚法測(cè)IgG濃度，繪制了純化過(guò)程的洗脫曲線。純化的雞血清IgG用于制備兔抗雞血清IgG多克隆抗體。采用瓊擴(kuò)試驗(yàn)和Western Blot對(duì)兔抗雞血清IgG多克隆抗體進(jìn)行了鑒定，瓊擴(kuò)試驗(yàn)測(cè)得多克隆抗體的效價(jià)為1：16，Western Blot顯示出多抗與IgG的重鏈和輕鏈反應(yīng)的兩條特異性條帶。

5、>　　 采用上述方法純化兔抗雞IgG多克隆抗體血清，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，純化后的IgG達(dá)到電泳純。Folin-酚法測(cè)IgG濃度，繪制了純化過(guò)程的洗脫曲線。純化的兔IgG用于制備酶標(biāo)記兔抗雞IgG抗體，采用過(guò)碘酸鈉氧化法將HRP標(biāo)記到兔抗雞IgG血清IgG上，得到酶標(biāo)記兔抗雞IgG抗體。對(duì)所得到酶標(biāo)記兔抗雞IgG抗體的使用效果以及酶結(jié)合物使用稀釋度進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)酶標(biāo)記兔抗雞IgG抗體抗的使用效果比較好，可以進(jìn)行下面試驗(yàn)。所得的酶

6、標(biāo)記兔抗雞IgG抗體抗使用稀釋度為1：4000。
　　 本研究用上述所得到的抗原、雞抗NDV抗體和酶標(biāo)記兔抗雞IgG抗體建立了快速檢測(cè)NDV在CEF和COS-7細(xì)胞中的定位的免疫酶標(biāo)細(xì)胞化學(xué)法。通過(guò)方正法優(yōu)化出以下最佳反應(yīng)條件。確定該實(shí)驗(yàn)用4％多聚甲醛做固定劑結(jié)果較好，病毒接種量為100×TCID50，細(xì)胞孵育24h，雞抗NDV抗體在4℃反應(yīng)過(guò)夜，按1：50進(jìn)行稀釋?zhuān)笜?biāo)記兔抗雞IgG抗體在37℃反應(yīng)30min，按1：200進(jìn)行