新城疫病毒HN蛋白的可溶性超表達(dá)與免疫活性檢測(cè).pdf

1、新城疫（Newcastle disease,ND）被稱為亞洲雞瘟或者偽雞瘟。是由新城疫病毒（NDV）引起的急性高度接觸性傳染病。目前，新城疫在我國(guó)仍然十分流行，給我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，故新城疫的防治十分重要。
　　在我國(guó)主要以疫苗接種來(lái)防控該病的蔓延，使用傳統(tǒng)疫苗可以預(yù)防新城疫，但與傳統(tǒng)疫苗相比，將NDV基因組中一個(gè)或多個(gè)保護(hù)性抗原在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)從而制備成亞單位疫苗更具有安全性能高、穩(wěn)

2、定性好、易于批量生產(chǎn)及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。ND亞單位疫苗的制備主要以病毒囊膜表面的致病性糖蛋白為主。近年來(lái)新城疫亞單位疫苗的研究熱點(diǎn)仍以HN蛋白為主，它與病毒的致病性和免疫原性密切相關(guān)，是決定病毒毒力的重要因素。而大量制備HN蛋白主要以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為主，大腸桿菌作為外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)所需碳源價(jià)格便宜、細(xì)胞生長(zhǎng)迅速和易于規(guī)?；囵B(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。然而，目前在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性外源蛋白還比較困難。有研究表明，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，采用

3、融合標(biāo)簽與目的基因一起進(jìn)行融合表達(dá)可以提高目的蛋白的可溶性表達(dá)量，然而，目前沒有一個(gè)標(biāo)簽可以促進(jìn)所有目的蛋白的可溶性表達(dá)。
　　本試驗(yàn)采用融合表達(dá)的方法將人工合成的HN-SF基因分別與Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB這10種融合標(biāo)簽基因采用柔性接頭進(jìn)行連接，構(gòu)建10個(gè)重組表達(dá)載體，經(jīng)菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定及測(cè)序正確后，將這1

4、0個(gè)重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，用不同條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，并用生物軟件ImageJ分析并選出最佳誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的條件，篩選出能夠顯著促進(jìn)重組HN蛋白可溶性表達(dá)的標(biāo)簽。為了消除標(biāo)簽自身大小對(duì)表達(dá)量的影響，采用Western blot對(duì)所表達(dá)蛋白的含量進(jìn)行定量分析。同時(shí)檢測(cè)純化的重組HN蛋白能否形成衣殼樣納米顆粒，用透射式電子顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，純化的重組HN蛋白用免疫印跡和間接ELISA檢測(cè)其免疫活性

5、。
　　結(jié)果表明，成功將合成的HN-SF基因連接到帶有標(biāo)簽的10個(gè)表達(dá)載體上，經(jīng)菌液PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定正確，表明成功構(gòu)建含有6×His-Grifin-TEV-HN-SF、6×His-GST-TEV-HN-SF、6×His-MBP-TEV-HN-SF、6×His-NusA-TEV-HN-SF、6×His-SUMO-TEV-HN-SF、6×His-Thioredoxin-TEV-HN-SF、6×His-ProteinG-TEV-

6、HN-SF、6×His-γ-crystallin-TEV-HN-SF、6×His-ArsC-TEV-HN-SF、6×His-PpiB-TEV-HN-SF的10個(gè)表達(dá)載體。用不同的條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)并用生物軟件選出最佳誘導(dǎo)重組HN蛋白表達(dá)的條件為：誘導(dǎo)溫度為16℃、IPTG的濃度為0.4mmol/L、Amp的濃度為200μg/mL和LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。在最佳誘導(dǎo)條件下顯示：10個(gè)重組表達(dá)載體中只有N-端連接Pro

7、teinG標(biāo)簽沒有檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)，其余9個(gè)重組載體都有目的蛋白的表達(dá)。用ImageJ軟件對(duì)可溶性表達(dá)量進(jìn)行定量分析表明，pET3-HN可溶性表達(dá)量最高（62.7％），其次分別為pET2-HN（42.2%）、pET5-HN（40.8%）、pET6-HN（40.4%）、pET1-HN（39.5%）、pET7-HN（36.0%）、pET10-HN（27.3%）、pET9-HN（26.8%）、pET4-HN（5.2%）。篩選出融合標(biāo)簽MB

8、P能夠有效促進(jìn)HN蛋白可溶性表達(dá)。為了消除標(biāo)簽自身大小對(duì)表達(dá)量的影響，選出可溶性表達(dá)量最高的兩組（GST組和MBP組），用抗His標(biāo)簽的抗體對(duì)其可溶性表達(dá)量進(jìn)行定量分析，Western blot結(jié)果表明最佳融合標(biāo)簽是MBP標(biāo)簽。隨后對(duì)重組HN蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE分析無(wú)其它雜帶，表明純化的蛋白純度高，用超濾管濃縮純化產(chǎn)物，其濃度達(dá)到1.6mg/mL；在透射電子顯微鏡下觀察重組HN蛋白能組裝成衣殼樣納米顆粒的結(jié)構(gòu)，經(jīng)Western