間接免疫熒光法

1、間接免疫熒光,武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學教研室潘勤,外周血單個核細胞分離 ----- 葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法 [原理] 外周血單個核細胞（PBMC）包括淋巴細胞、單核細胞，其體積、形狀和比重與其他細胞不同。紅細胞和多核細胞比重較大，為1.092左右，而淋巴細胞和單核細胞比重為1.075左右。利用比重為1.077左右的分層液作密度梯度離心，使一定比重的細胞按密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。

2、,[材料] 1、淋巴細胞分層液（葡蔗糖-泛影葡胺，比重為 1.077±0.001g/L） 2、 2％臺盼藍染液 3、 Hank’s液或者RPMI-1640培養(yǎng)基 4、試管、吸管、水平離心機等,[方法]1、無菌采集靜脈血2ml注入盛有2ml Hank’s液（含100u/ml肝素）的試管中，混勻。2、吸取淋巴細胞分層液2ml加入離心管中，再將稀釋抗凝血液小心沿管壁加至分層液上，應(yīng)注

3、意保持兩者界面清晰。（關(guān)鍵）3、室溫2000r／min離心20min。管內(nèi)可分為四層。,4、用毛細吸管輕輕吸出乳白色的單個核細胞，加入另一支已含有2~5 mlHank’s液的離心管中，混勻。5、室溫下，1500 rpm離心10 min。6、棄上清，將PBMC用1ml PBS稀釋，混勻,間接免疫熒光檢測人外周血單個核細胞,原 理,材 料,PBMC兔抗人白細胞血清 (Ab1)FITC-抗兔單克隆抗體 (Ab

4、2),方 法,吸管取1滴PBMC液體（約10ul）滴加到標本片黑色圈圈背面中央, 靜止5-10分鐘，待PBMC干燥。 15 ml Ab1 加入玻片上濕盒內(nèi)孵育 30min。甩干玻片, 用洗脫液洗5次，甩干玻片玻片上加15 ml 熒光二抗 (Ab2) 濕盒內(nèi)孵育 30min。(避光操作)甩干玻片, 用洗脫液洗5次，甩干玻片用熒光顯微鏡觀察結(jié)果,RESULTS,思考題,為什么用間接免疫熒光法可檢測 PBMC細胞？,