雞催乳素和新城疫病毒F基因疫苗聯(lián)合免疫研究.pdf

1、PRL是禽類就巢發(fā)生和維持的關(guān)鍵激素，F(xiàn)蛋白是新城疫病毒的主要宿主免疫保護(hù)性抗原。主動免疫雞催乳素（Prolactin，PRL）和新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)F基因既可改變雌禽的繁殖性能，提高產(chǎn)蛋量，又可改善免疫性能。本研究應(yīng)用基因克隆、細(xì)胞培養(yǎng)、基因免疫、蛋白印跡等技術(shù)，構(gòu)建雞催乳素和新城疫病毒(NDV)FDNA重組表達(dá)質(zhì)粒，為研制雞催乳素和新城疫基因疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　1、雞PRL和N

2、DVF基因的原核表達(dá)與免疫特性鑒定
　　將雞催乳素和NDVF基因克隆于pGEX-6P-1載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21用0.5mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果分析PRL、F基因獲得高量表達(dá)，大小分別約為54kDa和86kDa，與預(yù)期結(jié)果相符，表達(dá)產(chǎn)物以融合蛋白包涵體的形式出現(xiàn)在沉淀中。Western blot結(jié)果表明，融合表達(dá)的GST-PRL和GST-F蛋白能與小鼠血清發(fā)生特異性反應(yīng)，證明其抗原性良好。經(jīng)包涵體洗液裂

3、解后得到純化蛋白GST-PRL和GST-F分別免疫ICR小鼠，獲得多克隆抗體，從而為PRL和F蛋白功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2、共表達(dá)PRL和NDVF基因的真核質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定
　　本研究成功構(gòu)建了重組真核質(zhì)粒pVAX-PRL、pVAX-NDVF和pVAX-PRL-F，酶切及測序鑒定正確。然后將這些重組真核質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，通過Western blot，可以檢測到目的蛋白，為上述3個重組真核質(zhì)粒的進(jìn)一步應(yīng)

4、用奠定了基礎(chǔ)。
　　3、PRL和NDVF蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒對雞生產(chǎn)性能和免疫特性研究
　　150日齡150只地方土雞隨機(jī)分為5組，每組30只。第1組為陰性對照組，注射PBS，第2、3、4、5組分別腿部肌肉注射免疫pVAX、pVAX-PRL、pVAX-F和pVAX-PRL-F，劑量為每只雞免疫100μg，21、42天后分別以相同的劑量加強(qiáng)免疫。結(jié)果顯示，三次免疫后3周免疫重組真核質(zhì)粒pVAX-PRL-F組，血清ELISA抗體等水

5、平是最高的。免疫后pVAX-PRL和pVAX-PRL-F組就巢天數(shù)比對照組和pVAX組降低了0.8和13.8天(P＜0.05)，300日齡平均產(chǎn)蛋總數(shù)pVAX-PRL和pVAX-PRL-F組增加了8.6和16.4個（P＜0.05），在免疫后38和42周，pVAX-PRL和pVAX-PRL-F組血清中PRL水平較對照組和pVAX組顯著降低，三次免疫后3周免疫pVAX-PRL-F組有較高的淋巴細(xì)胞特異性的增殖，且IL-4及IFN-γ含量較其