兔出血癥病毒單克隆抗體的制備與鑒定及其衣殼蛋白VP60基因表達(dá)產(chǎn)物的免疫活性鑒定.pdf

1、用提純的兔出血癥病毒(RHDV)——RH-84分離株的病毒子和大腸桿菌表達(dá)的兩種VP60重組融合蛋白作為免疫原,免疫BALB/C小鼠,取免疫脾細(xì)胞與SP2/0融合,制備雜交瘤細(xì)胞.以RHDV作為檢測原,用間接ELISA方法檢測,采取有限稀釋法亞克隆3次,初步篩選出10株針對RHDV的陽性雜交瘤細(xì)胞株,其中由pET5a-RHDV-VP60重組蛋白免疫制備的有3株:5/C4、6/F10、D/3,由pET5a-RHDV-VP60重組蛋白免疫制

2、備的有2株:5/B11、3/B5,由純化的完整病毒粒子免疫制備的有5株:RH-1、RH-2、16D6-1、16D6-2、16F2.經(jīng)過4次亞克隆,發(fā)現(xiàn)由純化的完整病毒粒子免疫制備的5株單克隆抗體ELISA陽性值高、性質(zhì)穩(wěn)定,無為IgG(n),而由VP60重組蛋白制備的5株單抗ELISA陽性值不高,且多為IgM,考慮到實(shí)際應(yīng)用的意義,對這5株雜交瘤細(xì)胞液氮凍存,留待以后繼續(xù)研究,故只對由純化的完整病毒粒子免疫制備的5株特異性單抗進(jìn)行了以下

3、研究.通過HI試驗(yàn),鑒定RH-1、RH-2有較高的血凝抑制能力(7log2、8Log2),16D6-1、16D6-2、16F2血凝抑制能力則較弱(2 log2、3 log2).經(jīng)Western-blot分析,這5株單抗除RH-1外,其他4株RH-2、16D6-1、16D6-2、16F2均和非熱變性RHDV VP60反應(yīng),5株單抗均能識別熱變性RHDV多肽條帶.又通過DOT-ELISA和TAS-ELISA試驗(yàn),結(jié)果表明5株單抗均是針對兔出

4、血癥病毒粒子的特異性單克隆抗體,而不與其他抗原(兔肝組織、新城疫病毒及禽流感病毒)發(fā)生反應(yīng).以上研究結(jié)果為5株單抗的廣泛應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ).該研究又用兩種表達(dá)產(chǎn)物分別免疫小鼠,以RHDV完整病毒子作為檢測原對制備的多抗血清進(jìn)行間接ELISA和HI檢測;結(jié)果兩種重組蛋白的鼠多抗血清ELISA反應(yīng)均為陽性(P/N>2.1),OD<,490>平均值分別為0.50、0.33,且血凝抑制價分別為4 Log2、3 Log2;進(jìn)一步表明VP60

5、基因的大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物具有原病毒的抗原性和免疫原性,能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生針對RHDV的免疫反應(yīng).我們又借助于兔抗RHDV自然感染多抗血清與2種重組蛋白進(jìn)行Western-blot分析,結(jié)果兩種重組蛋白均被兔抗RHDV多抗血清識別.以上試驗(yàn)結(jié)果表明,RHDV衣殼蛋白VP60基因的大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物——pET5a-RHDV-VP60重組蛋白(62kd)和pGEX-6P-RHDV-VP60重組蛋白(87kd)具備RHDV的免疫生物學(xué)特性,且pET5a