藍舌病病毒17型VP2蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定.pdf

1、藍舌病(bluetongue,BT)是一種由藍舌病病毒(bluctongue virus,BTV)引起的通過庫蠓等昆蟲傳播的非接觸性病毒性動物傳染病。主要感染反芻動物,為畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失,是國內(nèi)外動物疫病防疫監(jiān)測的重點。全世界共分離到至少24個血清型BTV,且各型間無交叉反應(yīng),因此快速的血清型檢測方法的建立是預(yù)防本病的關(guān)鍵,以便針對當(dāng)?shù)亓餍械难逍瓦x擇相應(yīng)疫苗控制本病。
　　 根據(jù)GenBank中已發(fā)表BTV17的L2基

2、因序列(M17438.1)設(shè)計1對引物,從感染BTV17的BHK-21細胞中提取病毒RNA,RT-PCR擴增L2基因。利用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達VP2蛋白。將L2基因克隆至pFastBacHTA供體質(zhì)粒,構(gòu)建重組供體質(zhì)粒pFast-VP2。重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞,獲得重組桿粒BAC-VP2。將重組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞,得到攜帶L2基因的重組桿狀病毒BACV-VP2。對轉(zhuǎn)染細胞進行SDS-PAGE

3、和Western Blot分析,結(jié)果顯示VP2蛋白在Sf9昆蟲細胞中得到成功表達,且重組蛋白主要以包涵體形式存在。重組VP2蛋白能夠與抗BTV17綿羊陽性血清發(fā)生反應(yīng),顯示出良好的抗原性.
　　 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的BTV17的L2基因序列(M17438.1)設(shè)計兩對引物,利用原核表達系統(tǒng)對L2基因進行分段表達。利用兩對引物以重組供體質(zhì)粒pFast-VP2為模板擴增出兩段目的基因A和B。將A和B基因分別克隆到原核表達載體

4、pET-30a中,構(gòu)建重組表達載體pET-A和pET-B。將pET-A和pET-B分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌BL21表達重組蛋白VP2-A和VP2-B。SDS-PAGE結(jié)果顯示重組蛋白VP2-A和VP2-B均能在大腸桿菌中得到大量表達,主要以包涵體形式存在。表達產(chǎn)物以8M尿素變性后利用Ni2+NTA樹脂對其進行變性純化。Westernblot結(jié)果表明兩段重組蛋白均能與抗BTV17綿羊陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),具備良好

5、的抗原性。
　　 以原核表達的重組蛋白VP2-A和VP2-B為免疫原共同免疫BALB／c小鼠,并通過常規(guī)雜交瘤技術(shù)將免疫后小鼠脾細胞與SP2／0細胞進行融合。以原核表達的兩段重組蛋白為主要檢測抗原,建立間接ELISA檢測方法篩選分泌抗VP2蛋白單克隆抗體(MAb)的雜交瘤細胞。將第一次篩選到的陽性克隆以真核表達的重組VP2蛋白為檢測抗原,通過間接ELISA方法進一步篩選,最終獲得2株能穩(wěn)定分泌抗BTV17 VP2蛋白MAb的雜交

6、瘤細胞株,分別命名為BTV17 VP2-3F4、BTV17 VP2-4H10(以下簡稱為3F4和4H10)。Western blot結(jié)果表明2株MAbs均與重組蛋白VP2-A和VP2-B發(fā)生特異性反應(yīng),而與空載體表達產(chǎn)物對照不發(fā)生反應(yīng),具備良好的反應(yīng)原性。間接免疫熒光結(jié)果表明,2株MAbs均與BTV17呈陽性反應(yīng),其中MAb3F4與BTV1～9、BTV11～23、茨城病病毒、中山病病毒、赤羽病病毒、牛輪狀病毒、牛呼腸孤病毒均呈陰性反應(yīng),