基因免疫法制備抗PERV衣殼蛋白單克隆抗體.pdf

1、內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(EndogenousRetrovirus，ERV)是指存在于動物體內(nèi)或體外培養(yǎng)細(xì)胞基因組內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄病毒，現(xiàn)已在人、猴、猩猩、貓、犬等哺乳動物，雞、鴨、鵪鶉等鳥類及魚類、爬行動物的體內(nèi)分離或觀察到這類病毒。20世紀(jì)70年代初，在豬的多種體外培養(yǎng)細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了自主釋放的C型反轉(zhuǎn)錄病毒粒子，即豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(porcineendogenousretrovirus，PERV)。由于豬的心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)等與人類

2、具有較大的相似性，一直是人類異種器官移植的首選供體。但是，自從1997年P(guān)atience等發(fā)現(xiàn)PERV在體外可以感染多種人源細(xì)胞以來，豬→人異種移植的PERV安全性問題引起了人們廣泛關(guān)注。 本實驗采用基因載體免疫的方法制備抗PERVGag蛋白的單克隆抗體。在已構(gòu)建的原核表達(dá)載體pGEX-gag的基礎(chǔ)上，PCR法將PERVgag基因(約1572bp)進(jìn)行擴(kuò)增和克隆并亞克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pVAXI。經(jīng)菌落PCR、單雙酶切鑒定以及核酸

3、序列測定，最終構(gòu)建成序列正確的真核表達(dá)載體，并將該質(zhì)粒命名為pVAX-gag。以4％span80和2％甘油作為免疫佐劑免疫五只雌性Balb/c小鼠，2個月后應(yīng)用間接ELISA法測定鼠尾血清的抗體效價，結(jié)果除1只血清效價為1：2000外，其余4只均達(dá)到1：4000。根據(jù)血清抗體效價的測定結(jié)果，選擇效價最高的小鼠脾細(xì)胞與鼠源SP2/0骨髓瘤細(xì)胞用聚乙二醇法(PEG)融合，采用1％HAT培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。約1周后選擇生長有融合細(xì)胞的克隆孔

4、以間接ELISA法進(jìn)行陽性克隆篩選，用有限稀釋法篩選陽性單克隆細(xì)胞株，經(jīng)過3～4次單克隆篩選后獲得了4株分泌抗PERVGag蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。效價測定結(jié)果表明其中1株單抗其細(xì)胞培養(yǎng)上清效價達(dá)到1∶100，腹水效價達(dá)到1∶8×105。通過Giemsa染色體染色鑒定法，證明所獲得的雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目接近小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù)目之和。用抗體亞類鑒定試劑盒對得到的4株雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行了亞類鑒定，除1株為IgG2b類

5、抗體分子外，其余3株為IgM類抗體分子。用Western-Blotting試驗、間接ELISA法對得到的單克隆抗體進(jìn)行了特異性鑒定，結(jié)果表明4株McAb既可與PERVgag基因的重組表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生特異性反應(yīng)，也可與PERV病毒粒子中的天然Gag蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。從Balb/c小鼠的腹腔中回收腹水，經(jīng)PEG6000沉淀粗提單抗后，用丙烯葡聚糖凝膠層析法(“分子篩，，)純化單克隆抗體。本實驗為進(jìn)一步建立PERV的單克隆抗體檢測技術(shù)奠定了物質(zhì)