鴨肝炎病毒的純化及其單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒(DHV，duckhepatitisvirus)引起的主要發(fā)生于3周齡以下雛鴨的一種傳播迅速、高度致死性的傳染病。本試驗(yàn)主要對鴨肝炎病毒進(jìn)行增殖、鑒定和純化，利用純化的病毒作為抗原免疫小鼠并建立了間接ELISA篩選方法，并經(jīng)過一系列的融合篩選成功制備了抗鴨病毒性肝炎的單克隆抗體，從而為實(shí)驗(yàn)室建立DVH的快速診斷方法及今后對DHV的研究奠定基礎(chǔ)。 本試驗(yàn)用鴨胚進(jìn)行DHV增殖，運(yùn)用Reed-Muench法測

2、定DELD50為10-7.12，0.2mL；鴨胚中和試驗(yàn)鑒定此DHV為I型鴨肝炎病毒；通過氯仿去脂、PEG反透析、DEAE52纖維素層析和超高速離心的純化方法對病毒進(jìn)行了純化。純化后的病毒經(jīng)負(fù)染在電鏡下觀察可看到圓形、大小均一、直徑約為15nm左右的病毒粒子。用純化的病毒液接種雛鴨，進(jìn)行回歸試驗(yàn)，可以引起雛鴨“角弓反張”的典型癥狀與肝臟出血等病理變化。 用純化的病毒作為抗原來免疫BALR/c小鼠后建立間接ELISA篩選方法。細(xì)胞

3、融合前經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，確定了間接ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株的最佳反應(yīng)條件，即：抗原包被濃度為50μg/mL，以1:5000稀釋的陰、陽性血清分別作為陰、陽性對照，反應(yīng)條件均以37℃50min為佳，酶標(biāo)二抗的工作濃度為1:6000。取免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，用間接ELISA方法篩選出3株陽性雜交瘤細(xì)胞株，將獲得的陽性細(xì)胞株用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆，篩選出2株能穩(wěn)定分泌McAb的細(xì)胞株，分別命名為1D10和586。

4、對這2株雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定性、染色體、亞類、抗原表位特異性、親和力、腹水效價、特異性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果如下：在經(jīng)過3個月的連續(xù)傳代和3個月后的復(fù)蘇檢測，其分泌抗體的能力差異不顯著，表明其穩(wěn)定性好；染色體數(shù)目平均在84—92條之間：經(jīng)亞類鑒定，2株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體類型均為IgG1亞類，輕鏈類型均為k鏈；經(jīng)抗原表位特異性分析，2株單克隆抗體的識別表位相同或相近；其相對親和力的測定結(jié)果是1D10>5B6；抗體效價為1D10>5B6，其中1D