貓杯狀病毒的分離鑒定及其單克隆抗體制備.pdf

1、貓杯狀病毒（Feline calicivirus,FCV）屬于杯狀病毒科的成員之一，是貓的一種重要病原。FCV感染貓后最常表現(xiàn)為上呼吸道炎癥，同時(shí)也可引起其它臨床疾病，如慢性胃腸炎和齒齦炎、跛行、流產(chǎn)、出血熱、尿道感染等。近年來(lái)，有高致病性的FCV毒株（VSD-FCV）在一些國(guó)家相繼爆發(fā)，該毒株可引起感染貓全身性多系統(tǒng)病變，死亡率較高。FCV在我國(guó)貓科動(dòng)物中感染較為嚴(yán)重，但尚未見VSD-FCV毒株的病原研究相關(guān)報(bào)道。因此，開展我國(guó) FC

2、V病毒分離及其基因序列分析，了解我國(guó)FCV與世界各地分離株之間的進(jìn)化關(guān)系，并建立FCV檢測(cè)方法，對(duì)FCV的防治具有重要意義。
　　本論文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　1. FCV分離鑒定與序列分析
　　本研究于2014年6月至9月間從湖北省武漢市某寵物醫(yī)院采集19只就診貓的鼻拭子、眼拭子和口腔拭子樣品共38份，病料處理后接種 F81細(xì)胞，有13份樣品出現(xiàn)細(xì)胞病變（Cytopathic effect,CPE），用FCV的

3、特異性引物進(jìn)行RT-PCR鑒定，結(jié)果顯示出現(xiàn)CPE的樣品均為FCV陽(yáng)性，證實(shí)分離到了13株FCV病毒。選其中一株病毒W(wǎng)H7-92113采用FCV特異性引物擴(kuò)增全基因組序列以及利用電鏡觀察病毒形態(tài)，進(jìn)一步證實(shí)為FCV。此外，為了分析我國(guó)FCV分離株的分子遺傳學(xué)特性，對(duì)分離所得13株FCV武漢分離株進(jìn)行ORF2（B-F區(qū)）片段測(cè)序，并和我國(guó)前期報(bào)道的8株FCV分離株以及世界各國(guó)分離株進(jìn)行ORF2（B-F區(qū)）基因序列和遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。結(jié)果顯

4、示，我國(guó)多株分離株與日本報(bào)道的II型的毒株遺傳距離較近，與世界其它各國(guó)分離株遺傳距離較遠(yuǎn)。
　　2.FCV WH7-92113株衣殼蛋白原核表達(dá)與純化
　　采用RT-PCR方法擴(kuò)增FCV WH7-92113株ORF2 B-F區(qū)基因，將所得片段克隆至pET-30a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中，鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，并經(jīng)測(cè)序證實(shí) pET30a-ORF2原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，將該載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株中，經(jīng) IPTG誘

5、導(dǎo)后收集菌體，進(jìn)行 SDS-PAGE。結(jié)果表明，目的蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。大量表達(dá)的目的蛋白經(jīng)純化后，采用 ELISA方法檢測(cè)該蛋白的抗原性，結(jié)果顯示該蛋白具有較好的反應(yīng)原性。
　　3. FCV單克隆抗體的制備
　　以FCV WH7-92113為抗原多次免疫BALB/c小鼠后，取血清效價(jià)高的小鼠脾臟制備免疫脾細(xì)胞，在PEG4000的作用下與活化的SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，隨后采用以FCV為抗原的間接ELISA方法對(duì)融合成