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文檔簡(jiǎn)介
1、貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)屬于杯狀病毒科的成員之一,是貓的一種重要病原。FCV感染貓后最常表現(xiàn)為上呼吸道炎癥,同時(shí)也可引起其它臨床疾病,如慢性胃腸炎和齒齦炎、跛行、流產(chǎn)、出血熱、尿道感染等。近年來(lái),有高致病性的FCV毒株(VSD-FCV)在一些國(guó)家相繼爆發(fā),該毒株可引起感染貓全身性多系統(tǒng)病變,死亡率較高。FCV在我國(guó)貓科動(dòng)物中感染較為嚴(yán)重,但尚未見VSD-FCV毒株的病原研究相關(guān)報(bào)道。因此,開展我國(guó) FC
2、V病毒分離及其基因序列分析,了解我國(guó)FCV與世界各地分離株之間的進(jìn)化關(guān)系,并建立FCV檢測(cè)方法,對(duì)FCV的防治具有重要意義。
本論文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
1. FCV分離鑒定與序列分析
本研究于2014年6月至9月間從湖北省武漢市某寵物醫(yī)院采集19只就診貓的鼻拭子、眼拭子和口腔拭子樣品共38份,病料處理后接種 F81細(xì)胞,有13份樣品出現(xiàn)細(xì)胞病變(Cytopathic effect,CPE),用FCV的
3、特異性引物進(jìn)行RT-PCR鑒定,結(jié)果顯示出現(xiàn)CPE的樣品均為FCV陽(yáng)性,證實(shí)分離到了13株FCV病毒。選其中一株病毒W(wǎng)H7-92113采用FCV特異性引物擴(kuò)增全基因組序列以及利用電鏡觀察病毒形態(tài),進(jìn)一步證實(shí)為FCV。此外,為了分析我國(guó)FCV分離株的分子遺傳學(xué)特性,對(duì)分離所得13株FCV武漢分離株進(jìn)行ORF2(B-F區(qū))片段測(cè)序,并和我國(guó)前期報(bào)道的8株FCV分離株以及世界各國(guó)分離株進(jìn)行ORF2(B-F區(qū))基因序列和遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。結(jié)果顯
4、示,我國(guó)多株分離株與日本報(bào)道的II型的毒株遺傳距離較近,與世界其它各國(guó)分離株遺傳距離較遠(yuǎn)。
2.FCV WH7-92113株衣殼蛋白原核表達(dá)與純化
采用RT-PCR方法擴(kuò)增FCV WH7-92113株ORF2 B-F區(qū)基因,將所得片段克隆至pET-30a表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中,鑒定篩選出陽(yáng)性克隆,并經(jīng)測(cè)序證實(shí) pET30a-ORF2原核表達(dá)載體構(gòu)建成功,將該載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株中,經(jīng) IPTG誘
5、導(dǎo)后收集菌體,進(jìn)行 SDS-PAGE。結(jié)果表明,目的蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。大量表達(dá)的目的蛋白經(jīng)純化后,采用 ELISA方法檢測(cè)該蛋白的抗原性,結(jié)果顯示該蛋白具有較好的反應(yīng)原性。
3. FCV單克隆抗體的制備
以FCV WH7-92113為抗原多次免疫BALB/c小鼠后,取血清效價(jià)高的小鼠脾臟制備免疫脾細(xì)胞,在PEG4000的作用下與活化的SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合,隨后采用以FCV為抗原的間接ELISA方法對(duì)融合成
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