兔出血癥病毒誘導(dǎo)BHK-21細(xì)胞凋亡及其VP60蛋白單克隆抗體制備.pdf

1、兔瘟是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起兔的一種急性、敗血性、高度致死性傳染病。目前關(guān)于RHDV的致病機(jī)理還不完全清楚，據(jù)報(bào)道RHDV可以在體內(nèi)誘導(dǎo)肝細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，推測(cè)細(xì)胞凋亡可能是RHDV致病的一種重要機(jī)制。RHDV衣殼蛋白VP60是病毒的主要免疫蛋白，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，研制其單克隆抗體，對(duì)于研發(fā)診斷試劑以及分析VP60的抗原表位等具有重要意義。

2、 【目的】本研究擬對(duì)RHDV體外誘導(dǎo)BHK-21細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期探討RHDV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特征及其可能的信號(hào)通路，為闡明RHDV致病機(jī)理提供一定的理論依據(jù)；以RHDV的重組VP60蛋白為抗原，制備其單克隆抗體，為研發(fā)RHDV診斷試劑及分析VP60抗原表位奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【方法】主要采用DAPI染色、DNA凝膠電泳、膜聯(lián)蛋白V-FITC聯(lián)合PI染色的流式細(xì)胞分析等方法對(duì)感染RHDV的BHK-21細(xì)胞的凋亡狀

3、況進(jìn)行觀察和測(cè)試；用pET-30a載體原核高效表達(dá)RHDV衣殼蛋白VP60，以純化重組VP60蛋白為抗原免疫注射BALB/c小鼠4次，制取免疫鼠脾細(xì)胞，用PEG-3000將其與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，制備雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)間接ELISA篩選和多次克隆化，獲得能分泌RHDV抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，并用Western-blot和間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)其單克隆抗體的特異性。 【結(jié)果】(1)300TCID50/mL RHDV的感染BH

4、K-21細(xì)胞，37℃培養(yǎng)24h后，開(kāi)始呈現(xiàn)細(xì)胞核固縮和梅花狀碎裂核，并出現(xiàn)凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡特征；培養(yǎng)48h后，細(xì)胞染色體抽提物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)明顯的DNA ladder現(xiàn)象；感染組細(xì)胞的Caspase-3活性明顯高于對(duì)照組細(xì)胞。 (2)獲得2株能分泌RHDV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為細(xì)胞株AE11和AH4。兩株單抗均能識(shí)別純化RHDV及其重組VP60蛋白，但只有AE11能與RHDV感染的：RK-13細(xì)胞產(chǎn)生特