具抗病毒活性無冗余氨基酸牛α干擾素(A亞型)表達(dá)策略研究.pdf

1、干擾素(Interferon，IFN)是由機體特定細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性的分泌型糖蛋白，是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分。在眾多干擾素類型中，干擾素α的廣譜抗病毒能力最為顯著。體外表達(dá)的重組牛α干擾素(Bovine Interferon-α，BoIFN-α)蛋白可以抑制水泡性口炎病毒(VSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和副流感病毒(PIV)等病毒的增殖和復(fù)制。至今為止，大腸桿

2、菌表達(dá)系統(tǒng)和巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是表達(dá)重組牛α干擾素的普遍系統(tǒng)。然而，重組牛α干擾素在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中多以無生物學(xué)活性的包涵體形式存在，在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中多存在蛋白表達(dá)不穩(wěn)定、產(chǎn)量低等問題。因此，探索出一套可以穩(wěn)定直接表達(dá)具有生物學(xué)活性無冗余氨基酸的重組牛α干擾素的方法就更具生產(chǎn)與應(yīng)用價值。
　　 本研究綜合多種有利于直接表達(dá)具有活性重組蛋白的條件創(chuàng)建了三種具抗病毒活性牛α干擾素表達(dá)策略，即大腸桿菌周質(zhì)分泌表達(dá)策略、大腸桿

3、菌內(nèi)含肽融合標(biāo)簽表達(dá)策略和巴斯德畢赤酵母分泌表達(dá)策略。前兩種表達(dá)策略利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，以原有pWL-BoIFN-α質(zhì)粒為模板，PCR獲得經(jīng)過遺傳密碼子優(yōu)化后的牛α干擾素A亞型基因，分別與信號肽基因和內(nèi)含肽基因無縫融合，構(gòu)建了pET-22b-pelB-BoIFN-α、pMal-c2X-SDI-BoIFN-α、pColdⅢ-SDI-BoIFN-α等一系列表達(dá)載體，最終實現(xiàn)具抗病毒活性的牛α干擾素A亞型蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的活性表達(dá)。

4、巴斯德畢赤酵母分泌表達(dá)策略，以新鮮牛肝臟提取的?；蚪M為模板，PCR獲得成熟肽天然牛α干擾素A亞型基因，將此基因連接入載體pPICZαA中，成功構(gòu)建畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZαA-BoIFN-α，實現(xiàn)牛α干擾素A亞型重組蛋白在真核畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的高效具活性分泌表達(dá)。
　　 三種具抗病毒活性表達(dá)策略共獲得了四種活性牛α干擾素蛋白，通過細(xì)胞病變抑制法，在MDBK細(xì)胞上檢測其對VSV和BVDV的抗病毒活性，并且對四種活性蛋白