鴨α-干擾素基因的原核表達及抗病毒活性研究.pdf

1、鴨α-干擾素成熟蛋白基因原核表達載體的構建、表達及生物活性研究根據(jù)本課題組克隆、構建的PBV220-IFN (ORF)序列，利用permer5.0設計引物擴增出成熟蛋白基因并克隆到PMD18-T載體，測序鑒定后將其連接到原核表達載體pET32a<'+>，轉化宿主菌BL21(DE3)，經(jīng) IPTG 誘導后獲得高效表達。表達的重組蛋白分子量大小約37 KDa，以包涵體形式存在，占菌體總蛋白的30％。重組蛋白經(jīng)鎳金屬螯合介質填料(Ni-MIA

2、C)后得到純化。 利用稀釋復性和柱上復性兩種方法對包涵體進行復性，以在DEF上抗VSV的生物學活性效價檢測其效價。稀釋復性中，通過添加L-Arg使鴨α-干擾素成熟蛋白得到初步復性，表現(xiàn)出800U/mg的抗VSV活性，對柱上復性的鴨α-干擾素成熟蛋白，得到比活力為12800U/mg的DuIFN-α成熟蛋白。 利用定量PCR的方法對受30U(15U/ml)DuIFN-α成熟蛋白保護的鴨胚層纖維細胞(DEF)中的DPV強毒進行

3、抗病毒活性檢測。結果顯示：在DPV感染后15 h內，重組鴨α-IFN抗DPV組的病毒核酸拷貝數(shù)與不加鴨α-IFN的陽性對照組之間差異不顯著(P>0.05)；從23h開始鴨α-IFN保護組的核酸拷貝數(shù)低于陽性對照組并在感染后47h-55h其拷貝數(shù)差異達到最大，差異顯著(P<0.05)；與陽性對照組的DPV拷貝數(shù)相比，鴨α-IFN保護組在55h時能減少病毒10<'8.83>個核酸拷貝數(shù)，相對抑制率為80％。表明重組鴨α-IFN能明顯抑制對數(shù)

4、期的DPV復制，具有進一步臨床應用的潛力。 鴨α-干擾素ORF序列的原核表達及生物活性研究根據(jù)本課題組克隆、構建的PBV220-IFN ORF序列，利用EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切其ORF后連接到原核表達載體pET32a<'+>，轉化宿主菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導后獲得表達。表達的重組蛋白分子量大小約42 KDa，以包涵體形式存在。利用鎳金屬螯合介質填料對表達產(chǎn)物進行純化和柱上復性。對復性的鴨α-干擾素ORF，利用鴨α