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1、根據(jù)C.J.Mclnnes等于1990年發(fā)表的綿羊IFN-γ基因序列設(shè)計(jì)并合成引物,以經(jīng)ConA誘導(dǎo)的綿羊(湖羊)脾臟淋巴細(xì)胞提取的總RNA為模板,用RT-PCR方法擴(kuò)增出長(zhǎng)度為554bp的目的基因片段。將該基因克隆到pMD18-T載體上,經(jīng)PCR、酶切鑒定和序列測(cè)定,結(jié)果表明獲得了綿羊IFN-γ基因的克隆。該基因包含綿羊IFN-γ基因的全長(zhǎng)為501個(gè)堿基的開放閱讀框,編碼166個(gè)氨基酸組成的功能蛋白。克隆到的綿羊IFN-γ基因與Gen
2、Bank上已公布的人、牛、山羊、馬鹿、馬、駱駝、豬、狗、貓和雞的IFN-γ核苷酸序列進(jìn)行比較,其同源性分別為75.2%、96.6%、99.0%、95.8%、83.0%、88.8%、86.6%、82.4%、53.9%、32.9%;氨基酸序列同源性分別為61.7%、94.6%、98.2%、92.2%、77.8%、86.8%、77.8%、76.0%、39.5%、6.7%。與已發(fā)表的其它品種綿羊相比較,核苷酸和氨基酸序列同源性都為100%。
3、 將綿羊IFN-γ基因亞克隆,插入到原核表達(dá)載體pPROEXHTa中,構(gòu)建成綿羊IFN-γ基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒pPROEXHTa-OvIFN-γ。經(jīng)PCR、雙酶切鑒定,表明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒為陽(yáng)性。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),陽(yáng)性菌落篩選后,以IPTG為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析,結(jié)果顯示,在分子量約為22.6 kDa處有明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶,與預(yù)期的融合表達(dá)蛋白大小一致。表達(dá)
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