綿羊γ干擾素（IFN-γ）基因的克隆、表達(dá)與抗病毒活性初步研究.pdf

1、根據(jù)C．J．Mclnnes等于1990年發(fā)表的綿羊IFN-γ基因序列設(shè)計(jì)并合成引物，以經(jīng)ConA誘導(dǎo)的綿羊(湖羊)脾臟淋巴細(xì)胞提取的總RNA為模板，用RT-PCR方法擴(kuò)增出長(zhǎng)度為554bp的目的基因片段。將該基因克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)PCR、酶切鑒定和序列測(cè)定，結(jié)果表明獲得了綿羊IFN-γ基因的克隆。該基因包含綿羊IFN-γ基因的全長(zhǎng)為501個(gè)堿基的開放閱讀框，編碼166個(gè)氨基酸組成的功能蛋白。克隆到的綿羊IFN-γ基因與Gen

2、Bank上已公布的人、牛、山羊、馬鹿、馬、駱駝、豬、狗、貓和雞的IFN-γ核苷酸序列進(jìn)行比較，其同源性分別為75.2％、96.6％、99.0％、95.8％、83.0％、88.8％、86.6％、82.4％、53.9％、32.9％；氨基酸序列同源性分別為61.7％、94.6％、98.2％、92.2％、77.8％、86.8％、77.8％、76.0％、39.5％、6.7％。與已發(fā)表的其它品種綿羊相比較，核苷酸和氨基酸序列同源性都為100％。

3、 將綿羊IFN-γ基因亞克隆，插入到原核表達(dá)載體pPROEXHTa中，構(gòu)建成綿羊IFN-γ基因原核表達(dá)重組質(zhì)粒pPROEXHTa-OvIFN-γ。經(jīng)PCR、雙酶切鑒定，表明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒為陽(yáng)性。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，陽(yáng)性菌落篩選后，以IPTG為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析，結(jié)果顯示，在分子量約為22.6 kDa處有明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，與預(yù)期的融合表達(dá)蛋白大小一致。表達(dá)