雞λ干擾素在桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)及其抗病毒作用研究.pdf

1、干擾素(Interferon，IFN)是脊椎動物病毒防御系統(tǒng)的重要組成部分，主要分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅲ型干擾素又稱λ干擾素(IFN-λ)，是2003年發(fā)現(xiàn)的一種新型干擾素家族。Ⅲ型干擾素不僅具有與Ⅰ型干擾素相似的抗病毒活性，而且具有與Ⅱ型干擾素相似的免疫調(diào)節(jié)功能。IFN-λ受體分布的特異性，表明IFN-λ能夠在一些上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞上發(fā)揮相對獨(dú)立和特異的抗病毒作用。本研究以ChIFN-λ為研究對象，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表

2、達(dá)重組ChIFN-λ，初步開展了其抗病毒活性研究。
　　本研究以雞腎組織提取的總RNA為模板，利用RT-PCR方法擴(kuò)增ChIFN-λ。序列分析表明ChIFN-λ全長561 bp，共編碼186個氨基酸，其中前23個氨基酸構(gòu)成ChIFN-λ信號肽。亞克隆其成熟蛋白編碼基因492 bp，將其克隆入pET-32a，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-ChIFN-λ，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析證

3、實(shí)表達(dá)產(chǎn)物為36 KD左右的融合蛋白，并且主要以不溶性包涵體存在。利用高親和Ni-NTA層析樹脂純化表達(dá)產(chǎn)物，將其作為抗原免疫BALB/c小鼠，制備ChIFN-λ的多克隆抗體，ELISA檢測血清抗體效價為1∶16000。分別將此血清與抗His單克隆抗體作為一抗，通過Western-blot檢測ChIFN-λ的原核表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果均在36 KD處出現(xiàn)特異性條帶。
　　為了使ChIFN-λ能夠以分泌形式表達(dá)，利用重疊PCR在ChIFN-

4、λ成熟肽序列前引入昆蟲細(xì)胞可識別的gp67信號肽序列，將其克隆至載體pFastBacTM1中，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFastBac-gp67SP-ChIFN-λ，轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，通過特異性位點(diǎn)轉(zhuǎn)座，將ChIFN-λ整合到Bacmid穿梭質(zhì)粒中，經(jīng)過篩選純化得到穿梭質(zhì)粒Bacmid-ChIFN-λ;用脂質(zhì)體介導(dǎo)穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，得到重組桿狀病毒AcMNPV-ChIFN-λ。間接免疫熒光和Western-blot試驗(yàn)證明帶有g(shù)p

5、67信號肽的重組ChIFN-λ在昆蟲細(xì)胞中呈現(xiàn)分泌表達(dá)。
　　在昆蟲細(xì)胞感染96h后，分別收獲細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解液，并通過水泡性口炎病毒(VSV)感染雞胚腎細(xì)胞(CEKC)的細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)測定細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解液的抗病毒效果，結(jié)果表明細(xì)胞培養(yǎng)上清中的重組蛋白表現(xiàn)出較高的抗病毒活性，上清的抗病毒效價為1.44×106 U/mL，昆蟲細(xì)胞裂解液的抗病毒效價為4.76×105 U/mL。以重組ChIFN-λ進(jìn)行對新城疫病毒(NDV)和

6、禽流感病毒(AIV)的抗病毒活性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重組ChIFN-λ對NDV和AIV有明顯的抑制其致細(xì)胞病變作用，在CEK細(xì)胞上的抗病毒效果分別為1.82×106U/mL和1.94×106 U/mL。
　　綜上所述，本研究成功克隆出ChIFN-λ全基因，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了具有分泌能力的重組ChIFN-λ，表達(dá)產(chǎn)物對VSV、AIV和NDV具有顯著的抗病毒效果。本研究說明重組ChIFN-λ具有良好的應(yīng)用前景，為體外大量制備高