重組鴨α、γ干擾素的研制及其抗病毒作用研究.pdf

1、近幾年隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和集約化程度的不斷提高，鴨病的種類也越來越多，其危害也越來越嚴(yán)重，目前流行嚴(yán)重的鴨病毒性疾病主要有鴨病毒性肝炎、鴨瘟、鴨流感等。干擾素系統(tǒng)是機(jī)體對(duì)抗病毒感染的重要防御系統(tǒng)。由于抗體、補(bǔ)體僅存在于血清和細(xì)胞外液中，故它們對(duì)在細(xì)胞內(nèi)繁殖的病毒無作用。而當(dāng)干擾素系統(tǒng)被激活后，血清干擾素可以在在幾分鐘之內(nèi)散布到身體的各種器官中，而細(xì)胞接觸干擾素只需幾分鐘，就產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)。并且，動(dòng)物可以在1～3周時(shí)間內(nèi)對(duì)其它病毒的重復(fù)感

2、染也有抵抗作用。根據(jù)干擾素的氨基酸序列、抗原性和細(xì)胞來源的不同可將其分為2個(gè)型：Ⅰ型干擾素的主要成員為α-干擾素和β-干擾素，Ⅱ型干擾素為丫干擾素。Ⅰ型干擾素具有較強(qiáng)的抗病毒功能，Ⅱ型干擾素抗病毒功能稍弱，但免疫調(diào)節(jié)功能較強(qiáng)。自1986年以來，各型重組干擾素相繼投放市場(chǎng)，在醫(yī)學(xué)臨床治療過程中發(fā)揮了巨大的作用，特別是對(duì)病毒性肝炎等的治療效果明顯。而且副作用較輕。相對(duì)而言，動(dòng)物干擾素的研究滯后許多，目前仍主要停留在基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)階段，且

3、大多數(shù)集中在豬、雞、魚等少數(shù)動(dòng)物，但近年來也取得了不小的進(jìn)步，目前已有商品化的豬、犬、雞等重組干擾素產(chǎn)品面市。近年來，鴨干擾素(Duck interferon，DuIFN)的抗病毒和疫苗佐劑功能也在更多的試驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。本研究的目的就是應(yīng)用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研制出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重組鴨α和γ干擾素并研究其抗病毒功能，為我國重組鴨干擾素的工程化生產(chǎn)及其在養(yǎng)鴨業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。研究主要從以下幾個(gè)方面展開： 1．經(jīng)Con

4、A刺激誘導(dǎo)鴨外周血單核細(xì)胞(PBMC)，應(yīng)用RT-PCR法擴(kuò)增出鴨α干 擾素(DuIFN α))基因并克隆到pMD 18-T載體，測(cè)序結(jié)果表明：擴(kuò)增片段是含 有信號(hào)肽的鴨α干擾素完整基因，與NCBI上登錄的DuIFN-α基因序列(accession number X84764)同源性為100％。亞克隆鴨α干擾素成熟蛋白編碼基因，將特異性片段連接至原核表達(dá)載體pET28a(+)，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-DuA，并進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)SD

5、S-PAGE分析，原核表達(dá)產(chǎn)物為約28kD的融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物約占菌體總蛋白的22.8％。表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。 包涵體經(jīng)變性、復(fù)性、濃縮、透析后，細(xì)胞病變抑制法測(cè)定結(jié)果表明，重組鴨α干擾素具有較高的抗病毒活性，約為2.66x10<'4>U/mg。2.提取經(jīng)刀豆素(ConA)誘導(dǎo)培養(yǎng)的鴨外周血淋巴細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR 方法擴(kuò)增出鴨γ干擾素全基因序列，亞克隆鴨γ干擾素成熟蛋白編碼基因， 將特異性片段連接到pMD

6、18-T載體上，測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增片段為鴨γ干 擾素成熟蛋白編碼基因序列，與NCBI上登錄號(hào)為AJ012254的DulFN-<,γ>序列 同源性為97.6％，然后將特異性片段連接到含分泌信號(hào)肽序列的pichia pastoris表達(dá)載體pPICZaA上，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移重組載體pPICZαA-DuG， pPICZmA-DuG經(jīng)SacI酶切線性化后電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母菌株SMD-1168。轉(zhuǎn) 化子經(jīng)PCR分析鑒定后，利用甘油增茵和甲醇誘