表達(dá)犬γ干擾素重組乳酸球菌的構(gòu)建及體外抗病毒活性檢測(cè).pdf

1、γ干擾素(IFN-γ)也稱為免疫干擾素，主要由活化T細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生，具有抑制病毒復(fù)制，抗腫瘤，抗寄生蟲(chóng)及免疫調(diào)節(jié)等作用，隨著養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展，犬的種類和數(shù)量增多，疾病尤其是病毒病危害犬的健康與生存，因此作為一種重要的免疫增強(qiáng)劑，犬γ干擾素(CaIFN-γ)作為病毒性疾病的預(yù)防、免疫治療及疫苗佐劑方面具有很好的應(yīng)用前景。
　　 為獲得抗CaIFN-γ蛋白的兔血清抗體，本實(shí)驗(yàn)將CaIFN-γ基因通過(guò)EcoR I、SalI酶切位點(diǎn)與表

2、達(dá)載體pET30a連接，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-CaIFN-γ，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)CaIFN-γ蛋白，SDS-PAGE和western blot結(jié)果顯示，重組蛋白約23 ku并主要以包涵體形式存在。重組蛋白純化后肌注家兔，制備出CaIFN-γ的抗血清，測(cè)得血清效價(jià)為1∶12800。
　　 依據(jù)乳酸球菌常用氨基酸密碼子的偏嗜性，對(duì)CaIFN-γ基因進(jìn)行了優(yōu)化并合成。以乳酸乳球菌pH誘導(dǎo)分泌型質(zhì)粒pAMJ399作為表

3、達(dá)載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pAMJ399-CaIFN-γ，并電轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌PSM565中，構(gòu)建重組乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565，通過(guò)自身產(chǎn)酸啟動(dòng)誘導(dǎo)。SDS-PAGE結(jié)果表明，菌體中可見(jiàn)約20ku的目的蛋白;Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)上清和菌體中都可見(jiàn)與兔抗CaIFN-γ抗體特異性發(fā)生反應(yīng)的約20ku的目的蛋白，可見(jiàn)CaIFN-γ蛋白在重組乳酸乳球菌中獲得了表達(dá)，重組蛋白既可以以分泌上清的形式

4、存在于培養(yǎng)液中，同時(shí)在菌體內(nèi)也存在表達(dá)的蛋白。
　　 為提高重組乳酸菌的表達(dá)量，通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)曲線及pH對(duì)生長(zhǎng)曲線的影響確定發(fā)酵罐發(fā)酵的條件，結(jié)果表明32℃，攪拌速度50rpm，6h后以0.5s/min速率補(bǔ)充50％葡萄糖可提高重組乳酸菌的活菌數(shù)，其中pH維持在5.5和5.75時(shí)，培養(yǎng)上清中的表達(dá)量分別約為460ng/ml和400ng/ml要多于pH在6和6.25的表達(dá)量。
　　 為檢測(cè)重組乳酸乳球菌表達(dá)CaIFN-γ的抗病

5、毒活性，將重組菌誘導(dǎo)的菌液上清，過(guò)濾除菌后通過(guò)倍比稀釋與MDCK細(xì)胞共孵育24h，接種水皰性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)進(jìn)行攻毒檢測(cè)CaIFN-γ的抗病毒活性，30h后顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況，可見(jiàn)與CaIFN-γ共孵育組的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，而未添加CaIFN-γ的對(duì)照組細(xì)胞發(fā)生明顯病變，細(xì)胞圓縮、聚集、脫落;通過(guò)MTT法檢測(cè)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可見(jiàn)，5倍濃縮上清的CaIFN-組相比病毒組差異極顯著(

6、P＜0.01)，可見(jiàn)重組乳酸乳球菌分泌的CaIFN-γ上清具有良好的抗病毒活性;應(yīng)用SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定干擾素作用后的MDCK細(xì)胞攻毒之后的病毒感染量，可見(jiàn)重組菌組pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565與空載體組pAMJ399/PSM565和病毒組的ACt值相比較差異均顯著(P＜0.01)，表明重組菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565分泌上清5倍濃縮作用的MDCK細(xì)胞攻毒后的病毒載量明顯低于病毒組，