雞α干擾素的克隆、原核表達(dá)及其抗病毒效果研究.pdf

1、干擾素是一類動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的多功能蛋白，它可由病毒感染而自發(fā)產(chǎn)生并隨血液循環(huán)至全身，激活細(xì)胞內(nèi)抗病毒作用機(jī)制合成各種抗病毒蛋白以抵抗病毒的侵?jǐn)_。由于它高效的廣譜抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)活性以及其無可替代的臨床應(yīng)用價(jià)值，從人類發(fā)現(xiàn)干擾素開始，就從未停止過對(duì)它的探索研究。近年來，各種動(dòng)物干擾素的研究取得了突破性進(jìn)展，尤其是α干擾素在抗病毒感染等方面顯出良好的效果。我國(guó)是最大的養(yǎng)禽國(guó)，然而病毒病一直困擾著我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)，造成養(yǎng)禽業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此需

2、要干擾素類細(xì)胞因子和DNA重組技術(shù)生物治療制劑來防治禽類疾病。 本研究著眼于克隆并表達(dá)雞α干擾素（ChIFN-α），在體內(nèi)和體外探討重組ChIFN-α蛋白抵抗禽類病毒的效果。具體的研究有以下幾個(gè)方面： 1．ChIFN-α基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá) 通過PCR從三黃肉雞的肝臟基因組中擴(kuò)增了ChIFN-α全長(zhǎng)基因，序列分析表明ChIFN-α基因全長(zhǎng)582bp。亞克隆其成熟蛋白編碼基因489bp，利用基因重

3、組技術(shù)構(gòu)建了E.coli／pET-28a（＋）-IFNα，使IFNα置于pET-28a的T7啟動(dòng)子下游并同6×His-Tag（多聚組氨酸標(biāo)簽）融合。經(jīng)酶切鑒定，DNA測(cè)序證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確；經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)產(chǎn)物為22kD左右的融合蛋白，并且蛋白以不溶性的包涵體形式存在。Westem-blot印跡及斑點(diǎn)雜交分析證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫學(xué)活性。 2．兩種純化方法獲得的表達(dá)蛋白產(chǎn)物的抗病毒效果比較研究 通過

4、提取包涵體法和鎳親和層析法分別對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，變性和復(fù)性，獲得了具有較高生物活性的重組雞干擾素，提純的包涵體可占總蛋白的70％以上，用鎳親和層析方法純化蛋白則可達(dá)到95％。對(duì)這兩種方法提純的蛋白進(jìn)行了雞胚試驗(yàn)和雛雞試驗(yàn)，分析并比較了它們抵抗禽類病毒的效果，試驗(yàn)均表明親和層析純化蛋白是包涵體蛋白活性的20倍左右，表明蛋白純度越高，復(fù)性越好，生物活性也越好。 3．重組雞α干擾素抗禽類病毒效果 在體外試驗(yàn)中，復(fù)性的蛋白