重組奶牛α、γ干擾素的研制及其抗病毒作用.pdf

1、　近年來，牛干擾素的抗病毒和疫苗佐劑功能也在更多的試驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。本研究的目的就是應(yīng)用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研制出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重組牛α、γ干擾素并研究其抗病毒作用，為我國(guó)重組牛干擾素的工程化生產(chǎn)及其在養(yǎng)牛業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。研究主要從以下幾個(gè)方面展開：1.應(yīng)用RT-PCR方法從經(jīng)刀豆素(ConA)刺激誘導(dǎo)的奶牛外周血淋巴細(xì)胞總RNA中克隆到牛γ干擾素成熟蛋白基因，與Genebank上登錄的γ干擾素基因(NM174086)同源

2、性為100﹪。然后將特異性片段連在PBV載體上進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析，原核表達(dá)產(chǎn)物為16KDa的重組蛋白，占菌體總蛋白的32﹪，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。經(jīng)7mol/L鹽酸胍的變性液溶解及0.5mol/L鹽酸胍復(fù)性液處理，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽、凝膠層析純化，細(xì)胞病變抑制法結(jié)果表明，重組牛IFN-γ具有較高的干擾素活性，約為6.0×105U/mg。2.提取經(jīng)新城疫病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)的奶牛外周血淋巴細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增出奶

3、牛α干擾素成熟蛋白基因，然后將特異性片段連接到pMD18-T載體，測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增片段為牛α干擾素成熟蛋白序列，與Genebank上發(fā)表的α1干擾素序列同源性為98﹪。然后將特異性片段連接到含分泌信號(hào)肽序列的pichiapastoris表達(dá)載體pPICZaA上，將重組質(zhì)粒經(jīng)SacⅠ酶切線性化后電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母菌株X-33。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR分析鑒定后利用甘油增菌和甲醇誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了BoIFN-α在畢赤酵母系統(tǒng)中的分泌表達(dá)。SDS-PAGE