羊傳染性膿皰病毒的分離鑒定及其保護性抗原基因重組山羊痘病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、羊傳染性膿皰病是由羊傳染性膿皰病毒（ORFV）引起綿羊、山羊等中小反芻動物及人的一種急性、高度嗜上皮性、接觸性傳染病。該病在世界各養(yǎng)羊業(yè)國家和地區(qū)廣泛流行，對養(yǎng)羊業(yè)的危害較大，經(jīng)濟損失嚴重。目前尚無有效的藥物用于該病的治療，疫苗接種被認為是控制該病流行可靠而有效的手段。常規(guī)的弱毒苗和滅活苗在預(yù)防該病的發(fā)生和流行過程中起到了一定的作用，能在一定程度上降低感染率，但存在病毒毒力返強，活病毒逃逸及病毒變異株的出現(xiàn)等不安全因素，導(dǎo)致疫苗的免疫保

2、護率不高。因此，有必要應(yīng)用基因工程手段開發(fā)一種新型的疫苗候選株，以更好的預(yù)防該病的發(fā)生和流行。
　　對采集新疆地區(qū)疑似羊傳染性膿皰病的羔羊結(jié)痂病料，用MDBK傳代細胞進行病毒分離培養(yǎng)及電鏡觀察，然后進行動物回歸實驗，對特異性目的基因進行PCR擴增，并將其克隆至pMD18-T載體中進行測序和序列分析及遺傳進化樹構(gòu)建；根據(jù)GenBank公布的ORFVB2L基因的核苷酸序列，利用PrimerPremier5.0軟件分析設(shè)計引物，使用PC

3、R技術(shù)從提取的質(zhì)粒中擴增B2L基因，構(gòu)建原核表達載體，將其轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，用SDS-PAGE及Westernblot檢測目的蛋白的表達情況及其反應(yīng)原性；采用篩選出的GTPV自身56bp雙向啟動子，通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組山羊痘穿梭載體；以同樣的方法選取P11和P7.5啟動子，構(gòu)建對照載體；將構(gòu)建好的重組山羊痘穿梭載體，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BHK-21細胞；利用X-gal篩選收獲的轉(zhuǎn)染產(chǎn)物，對篩選出的藍色蝕斑進行連續(xù)

4、擴增和傳代，直至得到較純的重組山羊痘病毒；利用PCR技術(shù)、RT-PCR技術(shù)檢測經(jīng)純化后得到的重組山羊痘病毒。
　　接種病毒后MDBK傳代細胞出現(xiàn)了細胞病變，實驗動物的羊只出現(xiàn)了典型的羊傳染性膿皰病的臨床癥狀，電鏡觀察到病毒粒子；PCR擴增出B2L基因長1137bp，F(xiàn)1L基因長1023bp，B2L基因序列分析表明該分離株與其它毒株間核苷酸和氨基酸的同源性分別為97.63％~99.91%和97.35%~100%，而F1L基因序列分析

5、表明與其它毒株間核苷酸和氨基酸的同源性分別為95.60%~99.61%和95.59%~99.71%。系統(tǒng)發(fā)育進化樹結(jié)果表明，該分離株B2L基因與印度分離株India67/04的親緣關(guān)系最近，而F1L基因與意大利分離株OV/C2的親緣關(guān)系最近；說明成功分離到了羊傳染性膿皰病毒，將其命名為ORFV-shz分離株；構(gòu)建了B2L基因原核表達載體pET-32a-B2L，SDS-PAGE分析表明獲得了約60kDa的融合蛋白；Westernblot檢