雞傳染性支氣管炎病毒的分離及其S1基因重組5型腺病毒的構(gòu)建.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(InfectiousBronchitis，IB)是由冠狀病毒科(Coronavirdae)冠狀病毒屬(Coronavirus)傳染性支氣管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus，IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大損失。雞傳染性支氣管炎在免疫雞群中的頻繁暴發(fā)，給該病的免疫防控帶來(lái)了極大的困難。
　　 本研究通過(guò)病毒形態(tài)觀察、致雞胚矮小化試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)等分離獲得1株雞

2、傳染性支氣管炎病毒，命名為QS10株。利用RT-PCR對(duì)其S、N基因進(jìn)行了擴(kuò)增和序列分析，并繪制了S1基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，QS10在電鏡下呈直徑80～120nm的圓形粒子，接種雞胚100％出現(xiàn)侏儒胚和死亡胚，血凝效價(jià)為1∶1024，EID50為107.38/0.2ml，該分離毒株與中國(guó)常用疫苗毒株、國(guó)內(nèi)流行毒株親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，而與澳大利亞流行毒株S1基因的核苷酸序列同源性達(dá)91.4％～99.6％，推測(cè)該毒株與澳大利亞流行

3、毒株可能具有相同的進(jìn)化來(lái)源。
　　 參照QS10株S1基因的全序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過(guò)RT-PCR克隆到S1基因，將其連接至pUC19載體，測(cè)序鑒定正確后，利用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切將S1基因從重組克隆質(zhì)粒上切下，連接至相同酶切處理的腺病毒穿梭質(zhì)粒載體pacAd5CMVK-NpA中，酶切及測(cè)序鑒定重組穿梭質(zhì)粒命名為pacAd5CMV-S1。利用限制性內(nèi)切酶PacⅠ將上述構(gòu)建好的重組穿梭質(zhì)粒線性化，與同樣利用PacⅠ酶切線性化

4、并回收的腺病毒骨架質(zhì)粒pacAd59.2-100共同轉(zhuǎn)染人胚胎腎HEK293AD細(xì)胞系，在HEK293AD細(xì)胞中完成同源重組，并包裝出攜帶S1基因的重組人5型腺病毒，命名為rAd5-S1，另外，利用線性化的pacAd5CMVK-NpA和pacAd59.2-100重組獲得的腺病毒命名為wt-rAd5;4～9代傳代后，各個(gè)重組病毒的培養(yǎng)滴度都能達(dá)到107TCID50。
　　 獲得重組病毒后，對(duì)其進(jìn)行電鏡觀察表明獲得的病毒具有典型的腺

5、病毒形態(tài);用重組腺病毒感染HEK293AD細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)RT-PCR，在轉(zhuǎn)錄水平上證明了重組腺病毒能夠介導(dǎo)靶基因在真核細(xì)胞中表達(dá);最后，對(duì)感染重組病毒后的HEK293AD細(xì)胞做間接免疫熒光染色和細(xì)胞總蛋白做Western-blot檢測(cè)，結(jié)果在蛋白水平上證明了靶基因在被感染細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 綜上所述，本研究從病死雞的腺胃組織中分離到一株與澳大利亞流行毒株可能具有相同進(jìn)化來(lái)源的雞傳染性支氣管炎病毒，命名為QS10株