大熊貓犬瘟熱病毒H、F基因重組山羊痘病毒的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、犬瘟熱(Canine Distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(Canine Distemper Virus，CDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病。CDV的感染呈世界性分布，并且可以在不同的物種間進(jìn)行傳播，除感染犬科外，浣熊科、大靈貓科以及貓科的部分成員均易感，動物感染 CDV后，表現(xiàn)多樣的臨床癥狀，且容易繼發(fā)其他病原微生物的感染，部分野生動物如小熊貓死亡率高達(dá)100％。近年來，隨著CDV的不斷變異和進(jìn)化，CD的宿主范圍不斷地擴(kuò)大，

2、已經(jīng)有大熊貓、小熊貓、虎以及獅等野生動物感染CDV的報道。目前，寵物犬瘟熱的預(yù)防主要依靠傳統(tǒng)的弱毒疫苗，雖然某些野生動物使用寵物傳統(tǒng)的弱毒疫苗在控制CDV上有一定作用，但對于大熊貓、小熊貓、黑蹄臭鼬等野生動物而言，其安全性和免疫效果均有很大的不足。因此，為了解決野生動物CD的免疫預(yù)防的問題，同時解決寵物弱毒疫苗毒力可能返強(qiáng)等問題，開發(fā)和研制更加安全、高效的新型犬瘟熱活載體疫苗具有重要的意義。
　　CDV是副黏病毒科、麻疹病毒屬成員

3、，CDV囊膜表面的血凝素蛋白（H）與融合蛋白（F）是誘導(dǎo)中和抗體的主要抗原。由于山羊痘病毒（Goatpox Virus）存在復(fù)制缺陷性，故在哺乳動物中為一過性感染，具有宿主限制性，安全性很高。因此山羊痘病毒是構(gòu)建表達(dá)犬瘟熱H與F基因重組疫苗的理想載體。
　　本研究參照GenBank上已公布的大熊貓CDV H與F編碼的基因序列，對其抗原保守結(jié)構(gòu)和識別區(qū)域進(jìn)行修飾，由北京六合華大基因公司合成，在已有pMDTK-PEL-EGFP載體的基

4、礎(chǔ)上，將 CDV保護(hù)性抗原 H、F基因分別克隆到pMDTK-pEL載體中，然后運(yùn)用酶切、連接將表達(dá)盒PELH、PELF分別構(gòu)建到pTK-Eg載體中，從而獲得重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pTK-H-Eg與pTK-F-Eg。分別將重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg與GTPV AV41株共轉(zhuǎn)染倉鼠腎細(xì)胞（BHK細(xì)胞），使其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組，獲得重組 CDV的H、F基因的山羊痘病毒，然后在非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）上加壓篩選，利用g