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文檔簡(jiǎn)介
1、山羊痘是一種急熱性傳染病,由山羊痘病毒(goatpoxvirus,GTPV)引發(fā),臨床上以出現(xiàn)發(fā)熱和全身起痘為典型特征,具有很高的發(fā)病率和死亡率。我國(guó)目前使用山羊痘弱毒疫苗AV41株來(lái)預(yù)防山羊痘,但其在我國(guó)部分省份尤其是南方部分地區(qū)的羊痘防疫過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)存在有安全隱患,可產(chǎn)生諸多不良反應(yīng),如全身發(fā)痘、孕羊流產(chǎn)等。因此,有必要進(jìn)一步研制更為安全有效的新型基因工程疫苗。
本研究利用分子生物學(xué)、病毒學(xué)和免疫學(xué)等方面的技術(shù)和手段,
2、以GTPV弱毒疫苗毒株AV41為模板,分別設(shè)計(jì)4對(duì)引物,PCR擴(kuò)增ORF5~ORF19和ORF149~ORF15兩個(gè)區(qū)域兩側(cè)共四個(gè)基因組片段,分別作為同源重組左側(cè)臂和右側(cè)臂;運(yùn)用分子技術(shù),分別將兩側(cè)重組臂相連,并在兩個(gè)重組臂中間插入報(bào)告基因EGFP和篩選基因gpt的表達(dá)盒,構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pLF-Eg和pRF-Eg;分別將轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pLF-Eg和pRF-Eg與GTPVAV41株共轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞),使其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源
3、重組,加壓篩選并純化重組GTPV;最后鑒定重組GTPV和檢測(cè)其生物學(xué)特性。
通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)研究,確定了GTPV基因組中的兩個(gè)病毒復(fù)制非必需區(qū),分別成功構(gòu)建了敲除掉GTPV毒力相關(guān)基因ORF5~ORF19之間共15個(gè)ORF和ORF149~ORF151之間共3個(gè)ORF的兩株重組山羊痘弱毒株。同時(shí)證實(shí)這兩個(gè)基因重組缺失毒株均可穩(wěn)定遺傳,并保持了親本毒株在細(xì)胞培養(yǎng)物中的生長(zhǎng)特性。這為研制更安全、高效的山羊痘基因工程弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)
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