金黃色葡萄球菌保護(hù)性抗原基因重組牛痘病毒的構(gòu)建與鑒定研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是一種能感染多種動(dòng)物的常見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性球菌。病原學(xué)調(diào)查表明，金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要病原之一，對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的危害較重。為了有效預(yù)防奶牛乳房炎的發(fā)生，目前迫切需要研究有效的金黃色葡萄球菌疫苗。為此，本項(xiàng)目開(kāi)展了以下研究工作：
　　 1.致奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌SHZ1株保護(hù)性抗原基因的克隆與序列分析：利用PCR技術(shù)從致奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌SHZ1株基因組中擴(kuò)增出FnBP基因和ClfA基因，克隆至T

2、載體并進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌SHZ1株FnBP基因與Genbank上公布的金黃色葡萄球菌FnBP（序列號(hào)為EF127872）的核苷酸序列同源性為99.86％。核苷酸序列中有兩個(gè)堿基發(fā)生變異，但均為同義突變。金黃色葡萄球菌SHZ1株ClfA基因與Genbank上公布的金黃色葡萄球菌ClfA（序列號(hào)為EF207779）的核苷酸序列同源性為96％，氨基酸序列的同源性為100％。
　　 2.金黃色葡萄球菌FnBP基因重組牛痘

3、病毒的構(gòu)建、鑒定與純化研究：將用SamⅠ單酶切將目的基因切下，并克隆至pSC11牛痘病毒載體，測(cè)序鑒定正向連接的陽(yáng)性克隆。選擇正向連接的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSC11-FnBP，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已感染牛痘弱毒株病毒的BHK-21細(xì)胞中，收獲轉(zhuǎn)染產(chǎn)物，并反復(fù)凍融，然后充分稀釋接種BHK-21細(xì)胞，利用藍(lán)白斑篩選重組牛痘病毒，連續(xù)傳代純化藍(lán)色蝕斑，結(jié)果傳代5次后得到較純的重組牛痘病毒。利用PCR技術(shù)、RT-PCR技術(shù)及Wester

4、n-blotting檢測(cè)經(jīng)純化后得到的重組牛痘病毒，證實(shí)外源基因FnBP已成功重組到牛痘弱毒株病毒基因組中，并隨著牛痘弱毒株病毒在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)、繁殖而復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。
　　 3.金黃色葡萄球菌FnBP基因重組牛痘病毒的生長(zhǎng)特性、安全性及免疫原性初步研究；利用BHK-21細(xì)胞測(cè)定非重組牛痘病毒與重組牛痘病毒的毒價(jià)（TCID50），結(jié)果表明重組外源基因的重組牛痘病毒與非重組牛痘病毒的毒價(jià)相比并沒(méi)有降低。重組牛痘病毒pS

5、C11-FnBP作為實(shí)驗(yàn)組，生理鹽水和牛痘弱毒株病毒作為對(duì)照組，對(duì)小鼠進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)免疫研究。通過(guò)對(duì)免疫小鼠體征及內(nèi)臟器官進(jìn)行病理切片觀察，結(jié)果證實(shí)重組牛痘病毒pSC11-FnBP對(duì)免疫小鼠無(wú)任何不良反應(yīng)，具有良好的安全性。通過(guò)檢測(cè)重組牛痘病毒免疫小鼠血清中IFN-γ和測(cè)定中性粒細(xì)胞吞噬功能證實(shí)構(gòu)建的重組牛痘病毒與牛痘弱毒株病毒相比可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較好的細(xì)胞免疫。攻毒試驗(yàn)表明，重組牛痘病毒對(duì)金黃色葡萄球菌具有一定的免疫保護(hù)作用。本研究為金黃色