羊傳染性膿皰病毒B2L基因重組山羊痘病毒的構建及初步評價.pdf

1、羊傳染性膿皰病是由羊傳染性膿皰病毒引起的綿羊、山羊等反芻動物以及人類的一種急性、高度嗜上皮性、接觸性傳染病。該病在世界養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達的國家和地區(qū)廣泛流行,危害較大,造成嚴重的經濟損失,目前尚無有效的治療藥物;接種疫苗被認為是控制該病可靠而有效的手段。當前常規(guī)弱毒苗和滅活苗存在毒力返強、不安全、免疫保護率不高等缺點,急需開發(fā)一種新型的候選疫苗株以便更好的預防該病的發(fā)生和流行。羊痘病毒作為載體表達外源基因的有效性已經被大量研究所證實。因此,本研

2、究選取商品化的山羊痘弱毒疫苗作為載體,構建表達羊傳染性膿皰病毒B2L基因的重組山羊痘病毒,并對其遺傳穩(wěn)定性、理化特性和免疫原性進行檢測和初步評價,旨在獲得能同時預防山羊痘和羊傳染性膿皰病的雙價基因工程疫苗。為此,本研究主要開展以下研究工作:
　　1.分離鑒定羊傳染性膿皰病毒。對新疆地區(qū)疑似羊傳染性膿皰病的羔羊唇部結痂進行采集,研磨過濾后接種Vero細胞,分離培養(yǎng)病毒,待出現明顯細胞病變時,收集細胞進行電鏡觀察;通過PCR技術擴增羊

3、傳染性膿皰病毒B2L基因,進行測序分析。同時對該分離株和Genbank上公布的中國其他省市區(qū)的30個分離株的B2L基因序列進行生物信息學分析并構建系統(tǒng)進化樹。實驗結果顯示:羊傳染性膿皰病毒接種細胞后出現明顯的細胞病變,通過電鏡觀察到200nm左右的病毒粒子;PCR技術檢測出了大小為1137bp的特異性目的片段。該分離株與其他分離株的核苷酸序列同源性為96.0％-99.1%,氨基酸的同源性為88.7%-99.2%;系統(tǒng)進化樹分析顯示該分離

4、株與NX/YC-2010分離株遺傳距離最近。
　　2.構建羊傳染性膿皰病毒B2L基因重組山羊痘病毒并研究其生物學特性。本研究利用同源重組技術構建含有良好免疫原性的ORFV011(B2L)基因的重組山羊痘病毒。采用PCR技術擴增B2L基因,通過分子克隆技術構建重組載體,并利用脂質體法將其轉染已接種山羊痘弱毒株病毒的BHK-21細胞,進行同源重組。利用X-gal藍白斑篩選重組山羊痘病毒rGPV-B2L。應用PCR、間接免疫熒光和Wes

5、tern免疫印跡等方法對重組病毒進行檢測與鑒定。通過TCID50對該重組病毒的理化特性進行評價。實驗結果顯示:本研究成功構建了重組病毒轉移載體。通過藍白斑篩選純化獲得了重組山羊痘病毒rGPV-B2L,并且連續(xù)傳代20次后重組病毒B2L基因能夠在BHK細胞中穩(wěn)定的復制、轉錄及表達。理化特性檢測顯示該重組病毒經55℃30min或紫外照射60min即可被滅活,且對強酸、強堿、有機溶劑等較敏感。
　　3.初步評價重組山羊痘病毒的毒力及免疫

6、效果。為了評價該重組病毒作為候選疫苗的免疫效果,本文采用初免-加強免疫的策略對6-8周齡的雌性小鼠進行皮下注射,通過間接ELISA檢測小鼠血清中的特異性抗體水平,通過雙夾心ELISA評估其細胞免疫和體液免疫水平,同時通過攻毒實驗對該重組病毒的免疫保護力進行評價。結果顯示:重組病毒候選疫苗首免后1周,血清中即可檢測到B2L特異性抗體;加強免疫后,血清中的抗體水平顯著升高,表明該重組病毒可激發(fā)較高的體液免疫。對IFN-γ和TNF-α等細胞因

7、子的檢測結果顯示,該重組病毒也可強烈地激活機體細胞免疫應答。因此,本研究證實該重組病毒候選疫苗能夠刺激小鼠產生特異性的細胞免疫應答和體液免疫應答。此外,我們通過攻毒實驗對重組病毒的保護力進行評價發(fā)現,本研究構建的重組病毒候選疫苗能夠提供有效地免疫保護作用。該研究結果為今后進行本體動物的免疫試驗及臨床的初步應用提供理論依據,同時也為ORFV免疫特性的闡明奠定基礎。
　　本研究結果表明我們成功分離到羊傳染性膿皰病毒,并且獲得了可穩(wěn)定表