新城疫病毒融合蛋白結(jié)構(gòu)域基因免疫與雞白介素-2佐劑作用研究.pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文新城疫病毒融合蛋白結(jié)構(gòu)域基因免疫與雞白介素2佐劑作用研究姓名：張桂芝申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：方維煥20050501摘要摘要新城疫(Newcastledisease，ND)是對養(yǎng)禽業(yè)危害最嚴(yán)重的急性傳染病之一，該病病原新城疫病毒(Neweastlediseasevirus，NDV)屬于副粘病毒科腮腺炎病毒屬，是一種有囊膜的負(fù)鏈RNA病毒，在其囊膜上有兩種重要的功能蛋白纖突，即融合蛋白(F)和血凝素一

2、神經(jīng)氨酸酶(HN)，它們是NDV的致病基礎(chǔ)和主要宿主保護性抗原，已經(jīng)證明以F基因和HN基因為免疫原所研制的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)～定程度的免疫應(yīng)答，但由于這兩種蛋白分子量較大，且其免疫原性主要決定于抗原表位，故我們構(gòu)建了表達(dá)F蛋白結(jié)構(gòu)域基因片段的DNA疫苗，探討用其進行免疫預(yù)防的可行性。雞白細(xì)胞介素一2(cllickenImedeukin2，chlL2)是活化的雞T淋巴細(xì)胞分泌的一種淋巴因子。它能激活T細(xì)胞，促進B細(xì)胞分化及分泌抗體，增強單

3、核細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷活性，在機體的免疫反應(yīng)中具有十分重要的調(diào)節(jié)作用，是一類天然的免疫增強劑。我們對cML一2進行了克隆和表達(dá)，并將其與NDVF基因DNA疫苗進行聯(lián)合免疫，探索其能否增強NDVDNA疫苗的免疫效果。本研究用PCR方法獲得了NDVF蛋白結(jié)構(gòu)域基因Fa和Fb，并通過重疊一延伸PCR對二者進行重組，獲得了Fab片段。將三種基因片段插入原核表達(dá)載體pGEX6P一1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得了表達(dá)，Western

4、blowing檢測表明表達(dá)的蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。用RTPCR方法從經(jīng)ConA誘導(dǎo)的雞脾臟淋巴細(xì)胞獲得了chlL。2eDNA，并進行了克隆，序列分析表明獲得的基因序列與GenBank上登錄序列一致。將c11IL2基因克插入原核表達(dá)載體pGEX6P一1和pET30a，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEX—IL2和pETIL2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后均獲得了正確的表達(dá)。pGEX—IL2表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后免疫家兔，制備的多克隆抗體能夠與純