產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素快速診斷金標(biāo)試紙條的研制及初步應(yīng)用.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Cl.perfringens)是一種廣泛分布于自然界中的條件性致病菌，其引起的家畜“猝死癥”發(fā)病急，死亡快，發(fā)病率和死亡率高，給養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。α毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌最重要的毒力因子，各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均可產(chǎn)生α毒素。目前，對(duì)家畜產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的診斷主要依賴于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷，但其操作過程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，不適用于該疫病的防控。因此，建立一種針對(duì)α毒素快速準(zhǔn)確的診斷方法，并能應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)的快速診斷是十分必要的。

2、r>　　 本實(shí)驗(yàn)首先采用分子生物學(xué)方法獲得α毒素表達(dá)質(zhì)粒；用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，摸索最優(yōu)表達(dá)條件；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳，獲得大小為45KD的融合蛋白；在最佳條件下大量誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，鎳柱親和純化目的蛋白，Westernblot檢測(cè)表明目的蛋白具有良好的免疫學(xué)活性。
　　 用表達(dá)純化后的α毒素蛋白作為抗原免疫家兔，四免后15d取血清獲得多克隆抗體。經(jīng)ELISA方法檢測(cè)抗體效

3、價(jià)可以達(dá)到1:512000,顯示了良好的特異性。采用硫酸銨沉淀法和透析袋純化抗體。
　　 膠體金免疫層析技術(shù)具有快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確直觀等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的特異性和敏感性，是目前現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用最廣泛的一種診斷方法。本實(shí)驗(yàn)用抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素多克隆抗體為探針制備了產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素快速診斷金標(biāo)試紙條。利用檸檬酸三鈉還原法制備了粒徑為40nm的膠體金，然后用其標(biāo)記抗α毒素多克隆抗體噴涂金標(biāo)墊，同時(shí)用純化的α毒素多克隆抗體和羊抗兔IgG二抗包被M

4、135硝酸纖維素膜分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，與金標(biāo)墊組裝成試紙條。對(duì)試紙條的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和重復(fù)性進(jìn)行檢測(cè)。用制備的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素快速診斷金標(biāo)試紙條對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，并比較其與PCR檢測(cè)結(jié)果的符合率。
　　 結(jié)果顯示，成功制備了α毒素快速診斷金標(biāo)試紙條，金標(biāo)墊上最佳抗體包被量為1mg/mL；檢測(cè)線上α毒素多克隆抗體最適印跡量約為600μg/mL；控制線上羊抗兔二抗的最佳包被濃度為1:20稀釋；當(dāng)α毒素質(zhì)量濃度為2.8