2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)是一種重要的人獸共患病的病原體,廣泛存在于環(huán)境中,極易污染食品及食品原料,并且耐高溫不易被殺死,可引起典型的食物中毒和腹瀉。在美國,由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒位居食源性腹瀉的第三位。目前國內(nèi)檢測(cè)食品中的產(chǎn)氣莢膜梭菌仍采用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法,操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、靈敏度較低,已經(jīng)不能滿足食品中致病菌快速靈敏的檢測(cè)需要,因此在臨床研究和食品安全方面,迫切地需要一種快速、靈敏、特異

2、的方法用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的早期檢測(cè)。幾年來,細(xì)菌檢測(cè)的新型分子生物學(xué)技術(shù)陸續(xù)被報(bào)道,如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),比傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法高速、特異性強(qiáng)、靈敏度高,但是由于需要昂貴的儀器、繁瑣的電泳操作以及較高的專業(yè)技術(shù),該方法不適宜在基層應(yīng)用。本研究建立了一套LAMP技術(shù)快速檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法,縮短了檢測(cè)時(shí)間,提高了檢測(cè)方法的靈敏性。
   本課題采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplifica

3、tion,LAMP)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌,靈敏度高,特異性強(qiáng),檢測(cè)方法簡(jiǎn)便,耗時(shí)短且檢測(cè)成本低。針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌(ATCC13124)GenBank中(基因號(hào)AY823400)α毒素全基因保守序列,運(yùn)用在線引物設(shè)計(jì)軟件(https://primerexplorerjp/lamp3.0.0/index.html)設(shè)計(jì)LAMP引物。對(duì)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、鎂離子濃度等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化,確定25μL的LAMP反應(yīng)體系為:內(nèi)引物(FIP和BIP)各1

4、.2μmol/L,外引物(F3和B3)各0.2μmol/L,環(huán)引物(LF)0.6μmol/L,2.5mmol/LdNTP,1mmol/LMgCl2,10×BstDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液,8U的BstDNA聚合酶大片段,2μLDNA模板和用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。LAMP反應(yīng)過程是首先在62℃水浴鍋中反應(yīng)20min,然后將其放入80℃水浴鍋中,水浴3min終止反應(yīng),通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀,即可判斷是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)。此外,取擴(kuò)增產(chǎn)

5、物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察梯形條帶,以證實(shí)是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)。
   為了比較LAMP檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的靈敏度和人工污染檢出限,以PCR方法作對(duì)照。PCR反應(yīng)的引物是LAMP反應(yīng)的兩條外引物(F3和B3)。結(jié)果表明,LAMP檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢出限為2.92×102CFU/mL,人工污染產(chǎn)氣莢膜梭菌的全脂乳的檢出限為15.7CFU/mL。采用試劑盒提取DNA,從樣品處理到報(bào)告結(jié)果,耗時(shí)1h。對(duì)照PCR耗時(shí)3h,檢測(cè)產(chǎn)氣莢

6、膜梭菌的檢出限為2.92×105CFU/mL,人工污染產(chǎn)氣莢膜梭菌的牛奶的檢出限為1.57×105CFU/mL。LAMP的靈敏度是PCR的10000倍。
   初步研究了5種模板制備方法對(duì)LAMP檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的影響。研究表明LAMP方法對(duì)制備模板DNA的要求不高,采用成本廉價(jià)熱裂解法抽提DNA,可以縮短反應(yīng)時(shí)間,整個(gè)反應(yīng)可在1h內(nèi)完成,比傳統(tǒng)的生化檢驗(yàn)方法減少了16~27h。研究表明LAMP將成為可以替代PCR的核酸擴(kuò)增新技

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