環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的研究.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)是一種重要的人獸共患病的病原體，廣泛存在于環(huán)境中，極易污染食品及食品原料，并且耐高溫不易被殺死，可引起典型的食物中毒和腹瀉。在美國，由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒位居食源性腹瀉的第三位。目前國內(nèi)檢測(cè)食品中的產(chǎn)氣莢膜梭菌仍采用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、靈敏度較低，已經(jīng)不能滿足食品中致病菌快速靈敏的檢測(cè)需要，因此在臨床研究和食品安全方面，迫切地需要一種快速、靈敏、特異

2、的方法用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的早期檢測(cè)。幾年來，細(xì)菌檢測(cè)的新型分子生物學(xué)技術(shù)陸續(xù)被報(bào)道，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，比傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法高速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，但是由于需要昂貴的儀器、繁瑣的電泳操作以及較高的專業(yè)技術(shù)，該方法不適宜在基層應(yīng)用。本研究建立了一套LAMP技術(shù)快速檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)方法的靈敏性。
　　 本課題采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplifica

3、tion，LAMP)檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌，靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便，耗時(shí)短且檢測(cè)成本低。針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌(ATCC13124)GenBank中(基因號(hào)AY823400)α毒素全基因保守序列，運(yùn)用在線引物設(shè)計(jì)軟件(https://primerexplorerjp/lamp3.0.0/index.html)設(shè)計(jì)LAMP引物。對(duì)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、鎂離子濃度等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，確定25μL的LAMP反應(yīng)體系為：內(nèi)引物（FIP和BIP）各1

4、.2μmol/L，外引物（F3和B3）各0.2μmol/L，環(huán)引物(LF)0.6μmol/L，2.5mmol/LdNTP，1mmol/LMgCl2，10×BstDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，8U的BstDNA聚合酶大片段，2μLDNA模板和用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。LAMP反應(yīng)過程是首先在62℃水浴鍋中反應(yīng)20min，然后將其放入80℃水浴鍋中，水浴3min終止反應(yīng)，通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀，即可判斷是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)。此外，取擴(kuò)增產(chǎn)

5、物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，觀察梯形條帶，以證實(shí)是否發(fā)生了LAMP反應(yīng)。
　　 為了比較LAMP檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的靈敏度和人工污染檢出限，以PCR方法作對(duì)照。PCR反應(yīng)的引物是LAMP反應(yīng)的兩條外引物(F3和B3)。結(jié)果表明，LAMP檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢出限為2.92×102CFU/mL，人工污染產(chǎn)氣莢膜梭菌的全脂乳的檢出限為15.7CFU/mL。采用試劑盒提取DNA，從樣品處理到報(bào)告結(jié)果，耗時(shí)1h。對(duì)照PCR耗時(shí)3h，檢測(cè)產(chǎn)氣莢

6、膜梭菌的檢出限為2.92×105CFU/mL，人工污染產(chǎn)氣莢膜梭菌的牛奶的檢出限為1.57×105CFU/mL。LAMP的靈敏度是PCR的10000倍。
　　 初步研究了5種模板制備方法對(duì)LAMP檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的影響。研究表明LAMP方法對(duì)制備模板DNA的要求不高，采用成本廉價(jià)熱裂解法抽提DNA，可以縮短反應(yīng)時(shí)間，整個(gè)反應(yīng)可在1h內(nèi)完成，比傳統(tǒng)的生化檢驗(yàn)方法減少了16～27h。研究表明LAMP將成為可以替代PCR的核酸擴(kuò)增新技