產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素重組干酪乳桿菌表達(dá)及其免疫學(xué)評(píng)價(jià).pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)是創(chuàng)傷性氣性壞疽和人類食物中毒以及動(dòng)物壞死性腸炎、腸毒血癥的主要病原菌之一。其致病因子是菌體分泌的外毒素，根據(jù)產(chǎn)生外毒素的種類不同，可分為A、B、C、D和E5個(gè)血清型，其中α毒素(C．Perfringens alpha toxin，CPA)是各型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的共同毒力因子，也是A型菌產(chǎn)生的最主要毒素，其能破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，從而具有細(xì)胞毒性、溶血性、致死性和

2、皮膚壞死性等特性。疾病發(fā)生是腸道內(nèi)細(xì)菌大量繁殖產(chǎn)生毒素，經(jīng)消化道吸收發(fā)生的毒素中毒性疾病。
　　 針對(duì)本病腸道吸收毒素和細(xì)菌在腸道大量繁殖特點(diǎn)，設(shè)計(jì)以有效刺激腸道黏膜免疫系統(tǒng)，以阻斷疾病因子入侵機(jī)體的第一道防線進(jìn)行免疫預(yù)防對(duì)科學(xué)防治本病具有重要意義。本研究以干酪乳桿菌Lactobacillus casei ATCC 393（L．Casei 393）作為遞呈抗原的活菌載體，利用α毒素位點(diǎn)突變的基因片段(從核苷酸水平上將編碼第68位

3、組氨酸殘基突變成甘氨酸殘基，使其毒性喪失，仍保持完整抗原性）插入到乳酸桿菌載體，構(gòu)建了表面表達(dá)和分泌表達(dá)產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的重組乳酸桿菌系統(tǒng)。以此作為口服制劑，通過乳酸桿菌表達(dá)和傳遞外源抗原和乳酸桿菌本身的腸道黏附性特性、耐膽汁酸鹽、耐胰酶和對(duì)腸道的定植和益生作用，有效刺激機(jī)體腸道黏膜免疫系統(tǒng)，達(dá)到免疫防治產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素中毒的目的。
　　 以含有編碼產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白基因的PEG-30b-α質(zhì)粒為模板，根據(jù)表達(dá)載體融合表達(dá)

4、位點(diǎn)及干酪乳桿菌密碼子使用的偏愛性，應(yīng)用oligo6.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增出約924bp的目的基因，將該基因片段克隆到pMD18-T simple載體，并進(jìn)行了酶切、PCR鑒定，重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-α。重組質(zhì)粒經(jīng)SphⅠ和XhoI雙酶切，回收目的基因片段，分別與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pPG-1和pPG-2連接，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)L．Casei 393，篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行酶切、PCR和測(cè)序鑒定，重組質(zhì)粒命名為pPG-1-

5、α和pPG-2-α，重組干酪乳桿菌命名為pPG-1-α/L.casei393 和pPG-2-α/L.casei393。
　　 將獲得的兩種重組干酪乳桿菌以1％乳糖為誘導(dǎo)劑進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。細(xì)胞表面表達(dá)型及分泌表達(dá)型重組干酪乳桿菌經(jīng)誘導(dǎo)后的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，有約34kD的融合蛋白得到了表達(dá)，表達(dá)蛋白的大小與理論值相符。Western blot結(jié)果分析表明，表達(dá)的蛋白可被兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗血清所識(shí)別，間接免

6、疫熒光及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所表達(dá)的蛋白能夠在干酪乳桿菌菌體表面檢測(cè)到；分泌表達(dá)型重組干酪乳桿菌經(jīng)誘導(dǎo)后，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的菌體及培養(yǎng)上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)表明，有約34kD蛋白得到了表達(dá)，表達(dá)蛋白的大小與理論值相符。Western blot結(jié)果分析所表達(dá)的蛋白具有與天然毒素蛋白一樣的抗原特異性。
　　 為探討產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白的重組干酪乳桿菌系統(tǒng)作為活菌疫苗潛在的應(yīng)用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)以BALB/c小鼠為試驗(yàn)

7、動(dòng)物，進(jìn)行免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。免疫程序?yàn)椋簩?shí)驗(yàn)鼠口服接種109活菌量，每隔2w免疫一次，共免疫四次，每次連續(xù)免疫3d，一天免疫一次。同時(shí)，以口服空載體干酪乳桿菌及PBS為陰性對(duì)照。免疫后分別測(cè)定了小鼠糞便、陰道粘液、淚液樣品中抗α毒素分泌型IgA及小鼠血清樣本中抗α毒素的特異性IgG水平。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，口服免疫重組干酪乳桿菌后在小鼠糞便、陰道粘液、淚液樣品中均檢測(cè)到了特異性sIgA。同時(shí)在小鼠血清中亦檢測(cè)到了較高水平的血清抗體，說明構(gòu)

8、建的重組干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)可誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答，又可刺激機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)的體液免疫應(yīng)答。此外，對(duì)第四次免疫十天的小鼠進(jìn)行α毒素攻毒實(shí)驗(yàn)，以探討重組干酪乳桿菌所產(chǎn)生的α毒素抗體對(duì)鼠的保護(hù)作用，鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)表達(dá)α毒素干酪乳桿菌系統(tǒng)免疫鼠后產(chǎn)生的α毒素抗體能夠抑制A型產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌天然α毒素對(duì)鼠的攻擊。收集免疫后鼠血清做α毒素中和實(shí)驗(yàn)，也證明了血清有中和α毒素的能力。分析了兩種表達(dá)方式的重組干酪乳桿菌的免疫效果，結(jié)果表明分泌型的重組菌免疫