犬弓形蟲抗體金標(biāo)試紙條的研制.pdf

1、弓形蟲病是由弓形蟲引起的一種世界范圍流行的人獸共患寄生蟲病，幾乎能感染所有溫血?jiǎng)游锛安糠掷溲獎(jiǎng)游铮拗鞣秶鷱V泛。該病一方面會(huì)引起妊娠階段孕婦流產(chǎn)，胎兒畸形、先天性缺陷或死胎，造成嚴(yán)重后果;另一方面還會(huì)導(dǎo)致艾滋病患者、癌癥患者等免疫力低下人群出現(xiàn)心肌炎、肺炎或致死性腦炎等。
　　人主要通過攝入含有弓形蟲包囊的未煮熟的動(dòng)物肉類及被弓形蟲卵囊污染的水果、蔬菜、飲用水而感染弓形蟲。因此，對(duì)動(dòng)物弓形蟲感染的監(jiān)控與預(yù)防可有效控制弓形蟲的傳播流

2、行。犬在弓形蟲的生活史中扮演著重要角色，首先，犬可通過接觸貓糞便而將弓形蟲卵囊攜帶至人類生活區(qū);其次，如果人類食入含有包囊的犬肉則會(huì)有感染弓形蟲的可能。目前，弓形蟲病臨床血清學(xué)診斷方法主要有改良凝集試驗(yàn)(MAT)、間接血凝試驗(yàn)（IHA）、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等，這些方法具有較好的敏感性和特異性，但是需要在實(shí)驗(yàn)室條件下完成，且需要有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員及相關(guān)的實(shí)驗(yàn)儀器、器材，實(shí)驗(yàn)要求高，不適合野外環(huán)境下

3、檢測(cè)。而免疫膠體金法作為新興的快速檢測(cè)方法完全有潛力承擔(dān)并完成快速、簡(jiǎn)便的弓形蟲病診斷任務(wù)。
　　研究目的:原核致密顆粒蛋白GRA1、GRA7重組蛋白，建立間接ELISA方法檢測(cè)犬弓形蟲抗體，并與蟲體裂解蛋白TLA比較評(píng)價(jià)，選出較優(yōu)蛋白。利用該蛋白制備兔抗多克隆抗體，進(jìn)而建立免疫膠體金快速檢測(cè)方法，檢測(cè)犬弓形蟲抗體，為弓形蟲病快速診斷提供方法。
　　研究?jī)?nèi)容:
　　1.原核表達(dá)弓形蟲重組蛋白GRA1、GRA7，建立犬弓

4、形蟲抗體間接ELISA方法，選出較優(yōu)重組蛋白抗原，用于進(jìn)一步研究;
　　2.用選出的重組蛋白制備抗體、純化濃縮驗(yàn)證多抗反應(yīng)性;
　　3.制備犬弓形蟲抗體金標(biāo)試紙條，并進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　研究方法:
　　1.弓形蟲致密顆粒蛋白GRA1、GRA7的表達(dá)與純化
　　將實(shí)驗(yàn)室保種的含有重組質(zhì)粒pET28-GRA1的大腸桿菌DE3菌株及含有重組質(zhì)粒pET28-GRA7的大腸桿菌DE3搖床培養(yǎng)擴(kuò)增，收取茵體，用不可溶蛋白提

5、取液裂解提取目的蛋白。將提取蛋白跑SDS-PAGE后驗(yàn)證蛋白大小，并將目的蛋白做Western Blot驗(yàn)證反應(yīng)性后，透析、濃縮目的蛋白，稀釋至1mg/mL，-20℃保存。
　　2.弓形蟲蟲體裂解抗原TLA制備
　　將液氮保存蟲體復(fù)蘇接種Vero細(xì)胞后，收集弓形蟲速殖子，-80℃與室溫反復(fù)凍融3次后，超聲破碎，吸取上清稀釋至1mg/mL，-20℃保存。
　　3.犬弓形蟲抗體間接ELISA方法的建立及評(píng)價(jià)
　　分別

6、將GRA1、GRA7、TLA蛋白按照5μg/mL，5μg/mL，10μg/mL包被酶標(biāo)板，包被過夜并用脫脂奶粉封閉1h，加入待檢犬血清孵育1h，HRP標(biāo)記羊抗犬二抗孵育1h，加入底物顯色20min，用2M硫酸終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀450nm測(cè)定OD值。將ELISA檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)方法MAT、IFA共同檢測(cè)結(jié)果比較，SAS統(tǒng)計(jì)分析，驗(yàn)證建立方法可行性。并用受試工作者曲線ROC分析ELISA檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)方法穩(wěn)定性及統(tǒng)計(jì)分析敏感性、特異性。選出較

7、優(yōu)蛋白用于制備金標(biāo)試紙條。
　　4.多克隆抗體制備
　　將0.5mL的2mg/mL目的蛋白與等體積福氏完全佐劑混合成油包水狀態(tài)免疫兔，之后分別在一免后的2周、4周、6周將蛋白與福氏不完全佐劑混合進(jìn)行2免、3免、4免，免疫劑量減半。4免后7d時(shí)，采取少量血驗(yàn)證血清滴度及反應(yīng)性。驗(yàn)證后大量采血分離血清。用蛋白柱A純化IgG抗體，透析濃縮后稀釋至1mg/mL，-20℃保存。
　　5.免疫膠體金快速檢測(cè)方法建立及評(píng)價(jià)
　

8、　通過檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，優(yōu)化最佳蛋白包被量及pH值，將GRA7蛋白標(biāo)記膠體金后鋪金于金標(biāo)墊上，將GRA7蛋白點(diǎn)在檢測(cè)線上，控制線點(diǎn)兔抗GRA7多抗。將制備好的膠體金試紙條檢測(cè)犬血清，檢測(cè)結(jié)果與MAT、IFA確定結(jié)果比較、評(píng)價(jià)。
　　研究結(jié)果:
　　1.成功建立了以GRA1、GRA7、TLA為抗原用以檢測(cè)犬血清弓形蟲特異性IgG抗體的間接ELISA方法，蛋白包被濃度依次分別為5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL

9、，犬血清檢測(cè)稀釋濃度為1∶50，抗哺乳動(dòng)物IgA/G酶標(biāo)二抗稀釋濃度為1∶20000。將三種抗原建立的間接ELISA方法分別命名為GRA1-ELISA、GRA7-ELISA、TLA-ELISA，分別對(duì)259份犬血清檢測(cè)，陽(yáng)性率依次為16.2％，17.0％，16.2％。三種抗原建立的間接ELISA方法檢測(cè)樣品血清與IFA、MAT聯(lián)合確定結(jié)果比較，陰陽(yáng)性差異部分無顯著性差異(p＞0.05);陰陽(yáng)性相同部分統(tǒng)計(jì)分析Kappa值依次為Kappa

10、=0.7491，(95％CI:0.6390-0.8592); Kappa=0.8631,(95％CI:0.7803-0.9459);Kappa=0.8327,(95％, CI:0.7409-0.9245)，由統(tǒng)計(jì)Kappa值顯示GRA7-ELISA＞TLA-ELISA＞GRA1-ELlSA，所以GRA7重組蛋白建立效果最好。 ROC曲線分析顯示，GRA1-ELISA、GRA7-ELISA、TLA-ELISA曲線下面積(AUC)依次為0.

11、957(95％CI，0.919-0.995);0.973(95％CI，0.955-0.991);0.948(95％CI，0.911-0.986)，由于GRA7-ELISA的AUC最接近于1，所以GRA7-ELISA表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。研究結(jié)果表明GRA7蛋白具有較好的抗原性，可用于進(jìn)一步建立免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的研究。
　　2.成功制備兔抗GRA7多抗，以GRA7為抗原ELISA檢測(cè)滴度高于12800，以TLA為抗原ELISA

12、檢測(cè)滴度為3200。通過Western Blot驗(yàn)證制備純化后的GRA7抗體，表明其與GRA7、TLA在目標(biāo)蛋白大小處均有反應(yīng)性。最終確定最佳蛋白包被pH值為8.0，最佳蛋白標(biāo)記量為15.6μg/mL，金標(biāo)抗原最佳鋪金稀釋度為1∶10（50μL原液加450μL重懸液）;T檢測(cè)線GRA7蛋白劃線濃度為0.5mg/mL，C檢測(cè)線兔抗GRA7多抗劃線濃度為0.5mg/mL;穩(wěn)定性試驗(yàn)驗(yàn)證試紙條室溫保存至少一個(gè)月有效，4℃保存至少半年有效。

13、r>　　用GRA7為抗原的膠體金試紙條(GRA7-IC)對(duì)259份犬血清檢測(cè)，樣品陽(yáng)性率為15.8％，低于GRA7-ELISA樣品陽(yáng)性率(17.0％)。GRA7-IC與IFA、MAT聯(lián)合確定的陰陽(yáng)性血清比較，陰陽(yáng)性不同部分用McNemar chi-square統(tǒng)計(jì)分析無顯著性差異(p＞0.05);結(jié)果相同部分比較顯示Kappa=0.7889，(95％CI:0.6864-0.8914)，說明兩種方法具有較高一致性，結(jié)果一致正確率為94.2

14、％。檢測(cè)結(jié)果顯示該法敏感性為79.5％，特異性為97.2％。
　　研究結(jié)論:
　　1.建立了重組抗原GRA1、GRA7及TLA的弓形蟲抗體間接ELISA方法，重組GRA7-ELlSA敏感性、特異性高于GRA1-及TLA-ELISA;
　　2.成功制備兔抗GRA7抗體，ELISA及Western Blot驗(yàn)證該抗體與GRA7蛋白及蟲體裂解蛋白TLA均有良好的反應(yīng)性;
　　3.制備了犬弓形蟲抗體金標(biāo)試紙條，敏感性為7