產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素免疫組化檢測方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，C. perfringens）可產(chǎn)生多種致死性的外毒素，容易引發(fā)畜禽的各種產(chǎn)氣莢膜梭菌病，以及人們的食物中毒、創(chuàng)傷性氣性壞疽，嚴(yán)重影響人們身體健康，給各國的養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生造成了一定的損失，因此臨床上產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷非常重要。目前診斷該病的主要方法為病原菌的分離鑒定、腸內(nèi)容物的毒素檢測，產(chǎn)氣莢膜梭菌病主要是由腸源性感染引起，常形成腸源性毒血癥，并不一定形成菌血癥及敗血癥，

2、因此從內(nèi)臟實(shí)質(zhì)器官不一定能分離到細(xì)菌，若只從腸道分離到產(chǎn)氣莢膜梭菌沒有診斷價值；小鼠中和試驗(yàn)檢測發(fā)病動物腸內(nèi)容物中的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，已逐漸被更加敏感的ELISA方法所代替，但其作為疾病確診的依據(jù)也受到質(zhì)疑；特別是 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的疾病，腸道內(nèi)α毒素的檢測及分離到大量產(chǎn)氣莢膜梭菌都不能成為確診的依據(jù)，因此迫切需要一種方法能檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病作用以明確診斷。
　　本研究以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（NCTC528）為主要的產(chǎn)毒菌株，

3、進(jìn)行α毒素的高效厭氧產(chǎn)毒，通過 Enterotoxaemia ELISA kit、小鼠半數(shù)致死量（LD50）和SDS-PAGE方法測定所產(chǎn)培養(yǎng)物上清中的α毒素；應(yīng)用所產(chǎn)毒素對試驗(yàn)家兔進(jìn)行人工腹腔注射、肌肉注射α毒素，及時采集72h內(nèi)死亡家兔的器官組織：心臟、肺臟、脾臟、腎臟、膀胱、肝臟、胃、小腸、盲腸、大腦、小腦和延腦，制備組織切片，用于后續(xù)病理組織學(xué)檢查和免疫組化方法的優(yōu)化建立。結(jié)果顯示：所制備的同批次α毒素對小鼠的LD50為2-4.

4、25/mL，對家兔的最小致死量（MLD）為2 mL，即38倍小鼠 LD50；人工注射的α毒素通過血液循環(huán)致使胃絨毛上皮細(xì)胞空泡變性、壞死，小腸、盲腸的腸上皮細(xì)胞壞死、脫落，粘膜下層充血，還致使相關(guān)重要的實(shí)質(zhì)器官組織出現(xiàn)了充血、出血、紅細(xì)胞溶血及主質(zhì)細(xì)胞變性、壞死的急性損傷。以抗重組α毒素雜交瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體（2A11）為基礎(chǔ)（抗體效價達(dá)1:102400），通過對免疫組化程序中的組織固定、抗原修復(fù)、封閉條件、單抗2A11稀釋度、酶標(biāo)

5、二抗和DAB顯色等多個試驗(yàn)條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化，優(yōu)化建立了單抗介導(dǎo)免疫組化檢測方法。該方法可特異性的檢測到人工感染兔心臟、肺臟、脾臟、腎臟、膀胱、肝臟、胃、小腸、盲腸和延腦中的α毒素分布，其中胃、小腸、腎臟組織中的α毒素信號強(qiáng)度較強(qiáng)，主要分布于主質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，這為今后探討產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的致病機(jī)理提供了手段和參考。應(yīng)用建立的免疫組化法，結(jié)合病原分離培養(yǎng)、Multiplex PCR方法，對2013年10月~2015年9月期間采集的山東

6、省5個規(guī)?；脠鲆伤扑缶阅c炎病例進(jìn)行診斷，結(jié)果顯示：本研究共分離到32株產(chǎn)氣莢膜梭菌，毒素型均為A型，分離率為64％(32/50)。免疫組化檢測顯示：在50只疑似感染兔的器官組織中，有47只兔可檢測到α毒素，其陽性檢測率為94%，在采集的病兔腎臟、肝臟、胃和小腸組織中可檢測到α毒素陽性信號。本研究結(jié)果表明：山東省部分地區(qū)規(guī)模化兔場中發(fā)生的5起兔腹瀉疫情與產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染高度相關(guān)，94%發(fā)病兔感染了兔梭菌性腸炎，78.7%的發(fā)病兔出現(xiàn)