A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素防治制劑的研究.pdf

1、本研究的主要目的是利用熱休克蛋白HSP65與α毒素免疫原性部分融合表達來增強疫苗的免疫效果，另外在本實驗室前期通過全人源噬菌體抗體庫篩選獲得的針對α毒素的全人源單鏈抗體的基礎上，進一步深入地研究該單鏈抗體的生物學活性，并利用分子克隆技術構建針對α毒素的全人源雙價單鏈抗體以提高單鏈抗體的結(jié)合活性，為防治A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素引起的各類疾病奠定基礎。
　　本研究利用基因工程技術，以CPA全基因為模板，PCR擴增rCPA基因（敲除了CP

2、A編碼溶血性和致死性的酶活基因片段，保留具有免疫原性的部分），插入表達載體pET-28a(+)-HSP65，雙酶切及測序鑒定表明成功構建重組表達載體pET-28a-rCPA-HSP65，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，以IPTG于34℃誘導表達5 h，表達產(chǎn)物進行12％SDS-PAGE分析，重組蛋白的相對分子量大小約為90kDa，而且大部分是以可溶形式產(chǎn)生的，表達量占菌體總蛋白的30.17%。接下來從培養(yǎng)基類型、誘導溫度和誘導時間

3、對其表達條件進行優(yōu)化并進行高密度發(fā)酵表達，產(chǎn)物經(jīng)一步DEAE弱陰離子交換層析柱上純化和復性后，再經(jīng)金屬螯合層析純化，純度達到95%左右。將純品rCPA-HSP65按常規(guī)免疫程序免疫小鼠，以rCPA和HSP65蛋白做對照，然后利用間接ELISA方法檢測各組小鼠外周血抗體滴度大小并進行了比較，融合蛋白rCPA-HSP65免疫后的小鼠外周血中和抗體水平持續(xù)增長，并在三免后平均中和抗體效價達212左右，且rCPA-HSP65組免疫的血清抗體效價

4、明顯高于rCPA組。小鼠體內(nèi)毒素中和試驗顯示免疫血清可在體內(nèi)具有明顯中和α毒素的致死性作用。攻毒保護試驗顯示，以2×LD50的α毒素靜脈攻擊rCPA-HSP65免疫組的小鼠，可獲得80%以上的保護。
　　將全人源抗CPA-scFv的菌株進行高密度發(fā)酵并經(jīng)IPTG以28℃誘導表達6 h左右，發(fā)酵后的菌液經(jīng)過離心收集上清，先經(jīng)60%飽和硫酸銨鹽析，用PB懸起后在PBS中透析過夜，經(jīng)過金屬螯合層析的粗純以及rProtein A親和層析精

5、純，獲得純品scFv，相對分子量約為31 kDa，符合預期大小，純度為97%左右。WB法顯示在43 kDa處有一明顯的特異性免疫條帶，表明純化的scFv與CPA具有較好的免疫結(jié)合活性；利用表面等離子共振技術（SPR）進行結(jié)合動力學的精確分析，顯示scFv與CPA的平衡結(jié)合常數(shù)（KA）為2.02×1010（1/M），平衡解離常數(shù)（KD）為4.94×10-11（M）；利用scFv在體外可以中和CPA水解卵磷脂活性和溶血活性的特點，將不同量的

6、scFv與α毒素37℃下預先孵育2 h，然后分別于卵黃稀釋液和2%鼠紅細胞懸液以及羊血液瓊脂平板在37℃作用2 h，通過檢測反應后的卵黃稀釋液的OD620和紅細胞懸液離心上清的OD450以及觀察血瓊脂板上的溶血情況表明，scFv具有良好的抑制CPA卵磷脂酶C活性的作用并能有效中和CPA的溶血活性，且兩者均具有濃度依賴性；在體內(nèi)中和試驗中，2×LD50劑量的CPA與抗體孵育后靜脈注射小鼠，與對照組相比，毒素與抗體按1:10和1:15時可以

7、達到全部保護，而低于1:8時則會出現(xiàn)小鼠死亡，初步得出中和劑量為2×LD50毒素所需要的抗體最少劑量約為18.69 mg/kg，記為m(scFv)。在攻毒保護試驗試驗中，以2×m(scFv)的抗體靜脈注射小鼠，之后不同時間段以2×LD50攻毒，結(jié)果在注射抗體之后1小時攻毒保護率達到80%。在攻毒救治試驗中，以2×LD50劑量的毒素CPA提前靜脈攻毒小鼠，不同時間段用2×m(scFv)的抗體進行救治，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在30分鐘之內(nèi)救治率可達到8

8、0%以上，而超過1小時甚至2小時之后再救治小鼠幾乎全部死亡。結(jié)果表明用單鏈抗體救治CPA中毒時，快速準確診斷和及時治療是非常重要的。取CPA攻毒后抗體救治存活小鼠的各主要臟器進行病理組織學觀察，以攻毒后未救治而死亡的小鼠作對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未用抗體救治而死亡小鼠的臟器出現(xiàn)不同程度的嚴重病變，而用抗體救治存活小鼠病變輕微。
　　然而，與完整單抗分子相比，具有單一結(jié)合位點的scFv結(jié)合力相對較低。另外，scFv另一特點是分子量較小，在體內(nèi)

9、易被腎臟清除從而導致它的體內(nèi)不穩(wěn)定性。因此，我們利用分子克隆技術構建并表達了針對CPA的特異性雙價單鏈抗體并對其生物活性進行了初步研究，具體步驟如下：以單鏈抗體scFv全基因為模板，擴增兩條scFv基因片段并經(jīng)不同長度連接肽G4S或（G4S）3連接，亞克隆至原核表達載體pET-28a(+)，經(jīng)雙酶切鑒定及基因測序結(jié)果表明正確構建了雙價單鏈抗體sc(Fv)-G4S-sc(Fv)和sc(Fv)-（G4S）3-sc(Fv)，分別簡記為sc(F

10、v)2-5和sc(Fv)2-15。將重組載體轉(zhuǎn)化原核表達菌株E.coli BL21（DE3），經(jīng)IPTG于30℃誘導表達5 h并進行12%SDS-PAG分析鑒定，雙價單鏈抗體以包涵體形式表達為主，相對分子質(zhì)量與預期大小相同。對包涵體進行洗滌和變性溶解，經(jīng)銅離子金屬螯合層析粗純，目的蛋白洗脫液進行多步透析法復性，再經(jīng)rProtein-A親和層析純化和分子篩S-75最終精純，獲得純度較高的雙價單鏈抗體。利用間接ELISA法對雙價單鏈抗體與C

11、PA的結(jié)合能力進行評價，結(jié)果顯示sc(Fv)2-15與CPA的結(jié)合活性高于 scFv和sc(Fv)2-5。在體外毒素中和活性檢測中，等摩爾的scFv、sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15與CPA毒素孵育后分別與稀釋的卵黃液和鼠紅細胞懸液作用，結(jié)果顯示scFv、sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15均可有效中和CPA水解卵磷脂活性和溶血活性，且sc(Fv)2-15中和效果明顯高于scFv和sc(Fv)2-5。在攻毒保護試驗中比較等摩