新城疫病毒HN蛋白與F蛋白結(jié)構(gòu)域共表達對細(xì)胞融合的影響.pdf

1、新城疫(Newcastledisease，ND)是危害養(yǎng)禽業(yè)最嚴(yán)重的急性傳染病之一，該病病原新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)屬于副粘病毒科腮腺炎病毒屬，是一種有囊膜的負(fù)鏈RNA病毒，在其囊膜上有兩種重要的功能蛋白纖突，即融合蛋白(F)和血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)，它們是NDV的致病基礎(chǔ)和主要宿主保護性抗原，也是與細(xì)胞融合密切相關(guān)的兩個糖蛋白。既表達黏附蛋白又表達F蛋白的感染細(xì)胞能夠融合鄰近的細(xì)胞形成多核細(xì)

2、胞或稱核胞體，HN蛋白和F蛋白對于細(xì)胞融合來說都是必需的。 由于這兩種蛋白分子量較大不易表達，且其免疫原性主要決定于抗原表位，故本研究分析了HN蛋白的抗原結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了HN蛋白結(jié)構(gòu)域基因片段原核和真核表達重組質(zhì)粒，并利用本實驗室已經(jīng)構(gòu)建好的F蛋白結(jié)構(gòu)域基因片段真核重組表達質(zhì)粒，進行了HN和F蛋白共表達對細(xì)胞融合影響的實驗研究。 本文用PCR方法獲得了NDVHN蛋白結(jié)構(gòu)域基因HNa和HNb，并通過重疊-延伸PCR對二者進行重

3、組，獲得了HNa-L-b片段。將三種基因片段插入原核表達載體pET32c，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得了表達，Westernblotting分析證實表達產(chǎn)物HNa和HNb與NDV陽性血清具有免疫反應(yīng)性。根據(jù)westernblotting結(jié)果，將含HNa和HNb重組質(zhì)粒的重組菌大量表達，并通過鎳瓊脂糖凝膠純化，免疫家兔，制備了抗HNa和抗HNb的多抗。 將HN蛋白結(jié)構(gòu)域基因片段HNa、HNb和HNa-L-b插入真核表

4、達載體pcDNA3的CMV啟動子下游，構(gòu)建重組真核質(zhì)粒pcDNA3-HNa、pcDNA3-HNb。將這兩種質(zhì)粒和實驗室保存的重組質(zhì)粒pcDNA3-HN、pcDNA3-F和pcDNA3-Fa(c)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，分別用新城疫陽性血清和制備的多抗檢測，用FITC標(biāo)記的特異性二抗進行間接免疫熒光試驗，均可以觀察到特異性黃綠色熒光，說明重組質(zhì)粒能夠在HeLa細(xì)胞中表達具有免疫反應(yīng)性的目的蛋白。 將F全長、Fa(c)片段真核表

5、達重組質(zhì)粒分別與HN全長、HNa和HNb片段真核表達重組質(zhì)粒在脂質(zhì)體介導(dǎo)下逐一共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24h，F(xiàn)a(c)片段與HNa、HNb共轉(zhuǎn)染孔就觀察到了細(xì)胞融合，36h后每個共轉(zhuǎn)染孔都觀察到了細(xì)胞融合，同時用間接免疫熒光的方法也檢測到了細(xì)胞融合，即合胞體。單獨轉(zhuǎn)染孔均未觀察到細(xì)胞融合。試驗結(jié)果說明，不同組合共轉(zhuǎn)染對細(xì)胞融合都有一定促進，其中Fa(c)片段與HNa、HNb共轉(zhuǎn)染促融合更為明顯，可能與這三個片段較小易表達且保留了融合

6、所需的結(jié)構(gòu)有關(guān)。 本研究的目的是，對所選的HN基因結(jié)構(gòu)域片段篩選，選出表達量較高且有良好免疫反應(yīng)性的；探索F和HN基因結(jié)構(gòu)域片段重組質(zhì)粒共表達對細(xì)胞融合產(chǎn)生的影響。因此，本研究初步分析了HN蛋白的主要抗原表位，探討了同源HN蛋白和F蛋白共表達對細(xì)胞融合的作用。所選用的幾個片段表達的蛋白都具有抗原性；F蛋白與HN蛋白不同片段組合共轉(zhuǎn)染都可以促進細(xì)胞融合；不同組合對融合的促進程度不同，可能與所選取的片段有關(guān)。本研究對于進一步探明F和