HMGB1蛋白在雞新城疫病毒引起炎癥反應中的作用機制研究.pdf

1、新城疫是由新城疫病毒感染引起的一種高致病性的家禽病毒性疾病。因為新城疫具有較高的感染率和致死率，且在全球范圍內都可以傳播，所以威脅到全球養(yǎng)禽業(yè)。新城疫病毒感染禽類能激活宿主天然免疫反應，引起大量炎性因子表達，形成炎癥因子風暴，而不同毒株NDV感染后誘導細胞因子表達的水平存在差異。在被強毒NDV感染的禽類體內，其呼吸道和消化道黏膜等會產(chǎn)生出血等滲出性炎癥病理現(xiàn)象。作為一種晚期炎癥因子，由感染引起、被主動釋放至細胞外的高遷移率組蛋白B(Hi

2、gh mobility group box-1，HMGB1)具有促炎因子樣作用，是一種重要的炎癥調控因子，關于雞HMGB1蛋白的功能研究鮮有報道，雞HMGB1蛋白在新城疫病毒引起炎癥反應中所發(fā)揮的作用值得研究。為了更好的控制臨床上新城疫病毒感染引起的炎癥反應，降低由炎癥導致的感染禽類死亡提供理論指導，我們進行了以下的研究。
　　(1)本研究通過從CEF細胞和HeLa細胞中擴增出雞HMGB1和人HMGB1基因序列，并將雞HMGB1和

3、人HMGB1蛋白序列進行比對，發(fā)現(xiàn)兩者在A盒和B盒區(qū)域相似性較高，在羧基端有較大差異。通過構建pEGFP-N1-chHMGB1重組表達質粒，轉染至HeLa細胞后發(fā)現(xiàn)雞HMGB1定位于細胞核區(qū)域。通過半定量RT-PCR實驗，對成年SFP雞各組織臟器中HMGB1含量進行分析，發(fā)現(xiàn)雞HMGB1蛋白廣泛分布于雞體的各種組織中，其中法氏囊和腸道豐度較高，而肌肉和內臟器官豐度相對較低。
　　(2)本研究通過構建pET-28a-chHMGB1原

4、核表達載體，原核表達雞HMGB1重組蛋白，并免疫小鼠，五次免疫后取小鼠全血制備多克隆抗體，再通過融合免疫小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞，經(jīng)四次亞克隆后，獲得三株針對重組雞HMGB1蛋白的單克隆抗體。經(jīng)過實驗驗證，所制備的多克隆抗體和三株單克隆抗體均具有ELISA、Western Blot和IFA效價。對多克隆和單克隆抗體的細胞特異性檢測，發(fā)現(xiàn)該多克隆抗體特異性針對雞HMGB1蛋白，而三株單克隆抗體具有通用性，可以識別雞，人，鼠，猴，豬五種細胞中

5、的HMGB1蛋白。該單克隆抗體也可以中和HMGB1誘導的炎癥因子表達上調。該單抗的成功研制將為進一步研究雞HMGB1蛋白功能以及其在新城疫病毒感染過程中多發(fā)揮作用提供必須的生物學試劑。
　　(3)本研究對新城疫病毒感染細胞后對細胞內HMGB1蛋白影響進行了分析，我們使用Herts/33毒株感染DF1細胞和A549細胞后通過間接免疫熒光實驗證明新城疫病毒感染可以導致原本定位于細胞核內的HMGB1蛋白重新定位于胞質區(qū)域。同時我們又通過

6、Western Blot實驗和熒光定量PCR實驗驗證1MOI Herts/33感染DF1和A549細胞后，并不誘導細胞內HMGB1蛋白的表達量發(fā)生明顯變化。我們同時使用強毒株Herts/33和弱毒株La Sota感染A549細胞后，通過ELISA檢測試劑盒可以檢測到病毒感染后上清中HMGB1蛋白水平逐漸增加。這一結果說明新城疫病毒感染細胞并不直接誘導HMGB1蛋白表達量發(fā)生明顯變化而是誘導原本定位于細胞核內的HMGB1蛋白逐步遷移至胞質

7、區(qū)域，進而又釋放至細胞外環(huán)境。并且當使用不同劑量Herts/33毒株感染細胞后，發(fā)現(xiàn)這種病毒感染后誘導HMGB1蛋白釋放作用具有感染劑量依賴關系。
　　(4)本研究繼續(xù)對HMGB1蛋白對新城疫病毒在細胞內復制的影響進行了分析。我們首先將構建的FLAG-chHMGB1和FLAG-huHMGB1真核質粒轉染至DF1和A549細胞中并感染Herts/33毒株，結果顯示過表達HMGB1蛋白并不能影響新城疫病毒在細胞內的復制。同樣通過外源加

8、入HMGB1蛋白刺激后感染Herts/33病毒，結果顯示外源加入該蛋白也不影響NDV在細胞內的復制。為了充分驗證這一點，我們又使用兩種HMGB1抑制劑，丙酮酸乙酯和甘草酸和自己制備的chHMGB1中和抗體。在1MOI Herts/33病毒感染細胞后分別使用這兩種抑制劑或者chHMGB1中和抗體，結果顯示使用兩種不同類型的抑制劑或者chHMGB1中和抗體都不能抑制新城疫病毒在細胞中的復制。以上結果都說明HMGB1蛋白并不影響新城疫病毒在細

9、胞中復制。
　　(5)最后本研究分析了HMGB1蛋白對新城疫病毒激活NF-κB信號通路和誘導炎癥因子上調的影響。首先我們通過熒光定量PCR實驗和ELISA檢測證明新城疫病毒強毒株Herts/33和弱毒株La Sota都可以誘導細胞內炎癥因子IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-αmRNA水平上調，以及分泌至細胞上清中，并且分泌至上清中的炎癥因子水平具有感染劑量依賴作用。1MOI Herts/33病毒感染細胞后，NF-κB信號通路

10、被激活。以上實驗證明，新城疫病毒感染細胞可以通過激活NF-κB信號通路而誘導下游炎癥因子mRNA水平上調并分泌至細胞上清中。我們在新城疫病毒感染12h后加入HMGB1蛋白，發(fā)現(xiàn)外源加入HMGB1可以促進新城疫病毒激活NF-κB信號通路，以及誘導下游炎癥因子mRNA水平上調。當干擾HMGB1后可以抑制NDV激活NF-κB信號通路。我們又在病毒感染后使用HMGB1的兩種抑制劑和chHGMB1中和抗體，結果顯示HMGB1抑制劑和chHGMB1

11、中和抗體可以抑制新城疫病毒誘導的炎癥因子mRNA水平上調。我們又研究了在這一過程中參與其中的受體蛋白，通過干擾TLR3，RAGE和TLR4受體蛋白后檢測炎癥因子mRNA水平，結果顯示干擾RAGE受體和TLR4受體后，新城疫病毒誘導炎癥因子上調作用受到抑制。中和抗體體內實驗表明用chHMGB1中和抗體可以通過中和雞HMGB1蛋白的促炎因子樣作用而延緩由新城疫病毒感染引起的死亡。以上結果最終證明，新城疫病毒感染誘導HMGB1蛋白從細胞核遷移