含鈣腎結(jié)石患者腎組織中TRPV5的表達(dá).pdf

1、一、研究背景：
　　 泌尿系結(jié)石是泌尿外科最常見的疾病之一，也是一全球性的疾病。我國的泌尿系結(jié)石發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)，我國南方還是世界三個(gè)主要的泌尿系結(jié)石流行區(qū)之一。尿石癥有易復(fù)發(fā)的傾向，而目前的預(yù)防措施并不令人滿意。研究表明：發(fā)生草酸鈣結(jié)石后1年內(nèi)，有10％男性會(huì)發(fā)生新的草酸鈣結(jié)石，10年內(nèi)有50％會(huì)發(fā)生新結(jié)石。鑒于此，我們有必要對(duì)泌尿系結(jié)石的病因進(jìn)行研究，進(jìn)而有效預(yù)防泌尿系結(jié)石的發(fā)生及復(fù)發(fā)。
　　 目前認(rèn)為泌尿系結(jié)

2、石是多因素共同作用下所形成的，其病因主要有內(nèi)在的遺傳因素、代謝因素及外在的環(huán)境、飲食等因素，代謝因素是近年研究的熱點(diǎn)。病因?qū)W的研究已經(jīng)充分證實(shí)了體內(nèi)鈣的代謝異常是導(dǎo)致含鈣尿路結(jié)石的重要因素之一。含鈣結(jié)石是最常見的泌尿系結(jié)石，主要包括草酸鈣結(jié)石和磷酸鈣結(jié)石。雖然泌尿系結(jié)石的結(jié)石成分有多種，但至少90％以上為含鈣結(jié)石，其中約1/3存在著高鈣尿癥。研究表明，尿液中的草酸鈣和磷酸鈣的飽和度與尿鈣的濃度相關(guān)，尿鈣增高易于誘發(fā)或促進(jìn)含鈣結(jié)石的形成。

3、尿鈣的水平取決于腎小球的濾過和腎小管對(duì)鈣的重吸收，人體內(nèi)進(jìn)入腎臟的鈣85％在近曲小管和Henle袢粗支升段被動(dòng)重吸收，剩余約15％則在腎臟遠(yuǎn)曲小管后段（DCT2)和集合管(CNT)主動(dòng)重吸收。尿鈣的主動(dòng)重吸收過程是：鈣離子通過上皮細(xì)胞鈣離子通道蛋白（TRPV5）介導(dǎo)經(jīng)DCT2和CNT上皮細(xì)胞頂膜入細(xì)胞質(zhì)、與載體蛋白Calblindin-D28k結(jié)合并擴(kuò)散至細(xì)胞外側(cè)基底膜、通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NCX1和PMCA1b經(jīng)基底膜入血液循環(huán)。主動(dòng)重吸收雖

4、然只占鈣總的重吸收的少部分，但其不同于于被動(dòng)重吸收，它受甲狀旁腺素（PTH）、1，25-二羥維生素D3等多因子的調(diào)節(jié)，是一種耗能的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，因此是影響尿鈣水平的重要因素。
　　 TRPV5是尿鈣重吸收的上皮通道蛋白，主要表達(dá)于腎遠(yuǎn)曲小管和集合管上皮細(xì)胞管腔側(cè)，通過結(jié)合尿液中Ca2+主動(dòng)重吸收入機(jī)體，進(jìn)而調(diào)節(jié)尿鈣水平，維持機(jī)體鈣平衡。目前的多項(xiàng)研究顯示TRPV5表達(dá)下降或活性降低可能導(dǎo)致尿鈣水平升高?？梢?，TRPV5和高鈣尿、含鈣

5、腎結(jié)石之間可能存在某種聯(lián)系。本研究收集我院含鈣腎結(jié)石患者和正常無結(jié)石者腎皮質(zhì)的兩組標(biāo)本各5例，通過免疫組織化學(xué)、Western Blot以及熒光定量PCR技術(shù)，比較兩組間在形態(tài)學(xué)上的差異及TRPV5蛋白、TRPV5mRNA的表達(dá)差異，研究TRPV5在含鈣腎結(jié)石形成中的作用，從而為泌尿系結(jié)石病的預(yù)防提供理論依據(jù)。
　　 二、研究目的：
　　 通過比較鈣離子通道TRPV5在含鈣腎結(jié)石患者和正常無結(jié)石者腎中的表達(dá)差異，探討TR

6、PV5在含鈣腎結(jié)石形成中的作用，并為尋找尿石癥的有效預(yù)防措施提供理論依據(jù)。
　　 三、研究方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來源：
　　 實(shí)驗(yàn)分兩組，每組5例，共10例。結(jié)石組選24H尿液分析結(jié)果尿鈣水平高于正常的（>300mg/24h）且術(shù)后常規(guī)結(jié)石成分分析證實(shí)為含鈣結(jié)石的患者5例，男性2例，女性3例，平均年齡44歲，其中腎鑄型結(jié)石2例，多發(fā)性結(jié)石3例，于經(jīng)皮腎鏡取石術(shù)術(shù)畢退鞘時(shí)取少量腎皮質(zhì)。對(duì)照組5例尿鈣均正常，男性

7、3例，女性2例，平均年齡49歲，其中3例為UPJ梗阻患者，2例為腎癌患者，于開放手術(shù)時(shí)在腎臟正常極取少量腎皮質(zhì)，無皮質(zhì)萎縮等其他因素影響。5例患者術(shù)前經(jīng)B超和IVP等診斷均無結(jié)石，術(shù)中也未發(fā)現(xiàn)結(jié)石。每例標(biāo)本取樣均裝于滅菌處理的EP管中，加1ml樣品保護(hù)劑，于—80℃冰箱保存。
　　 2、H-E染色及免疫組織化學(xué)：
　　 切取每例標(biāo)本，大小為3*3mm-3*5mm，要求組織結(jié)構(gòu)完整，做成石蠟切片，先進(jìn)行常規(guī)H-E染色并證實(shí)

8、是腎皮質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)，然后以無TRPV5表達(dá)的SD大鼠肝臟組織作為陰性對(duì)照，分別進(jìn)行免疫組化染色，比較兩組之間在形態(tài)學(xué)上的差異。
　　 3、Western Blot：
　　 另取每例腎皮質(zhì)用蛋白提取試劑盒，依其步驟分別提取蛋白，經(jīng)垂直電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉過夜、一抗二抗孵育、化學(xué)發(fā)光、顯影定影等步驟行Western Blot，從蛋白水平比較TRPV5蛋白在兩組間的表達(dá)差異。
　　 4、熒光定量PCR：
　　 用T

9、RIzol法提取每例標(biāo)本的總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，從基因水平比較結(jié)石組和對(duì)照組TRPV5mRNA的表達(dá)差異。
　　 5、結(jié)合數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 四、研究結(jié)果：
　　 1、H-E染色及免疫組化結(jié)果
　　 普通光學(xué)顯微鏡下可見各例標(biāo)本經(jīng)H-E染色后散在的圓形紅染的腎小體和呈大小不等腔狀斷面的近曲小管、遠(yuǎn)曲小管及少數(shù)集合管，其中遠(yuǎn)曲小管及少數(shù)集合管的官腔較大，上皮細(xì)胞較小，呈

10、立方狀，排列緊密，由此可證實(shí)為腎皮質(zhì)標(biāo)本。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)結(jié)石組和對(duì)照組的腎遠(yuǎn)端小管和集合管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜均有棕黃色的陽性染色顆粒，而陰性對(duì)照未發(fā)現(xiàn)。結(jié)石組的腎小管上皮細(xì)胞脫落、結(jié)構(gòu)受損，完整的腎小管數(shù)量有所減少，并且其TRPV5的陽性染色強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組。
　　 2、Western Blot結(jié)果
　　 依據(jù)Quantity One4.62版軟件得出的各灰度值，對(duì)照組各例TRPV5的蛋白印跡基本相近，分析結(jié)果顯示統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)差異不顯著（153.91±3.44 vs 150.92±0.81 vs 148.70±2.31 vs 142.17±6.93，P>0.05）；結(jié)石組的灰度值分析亦顯示各例之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（96.89±22.92 vs 104.51±12.14 vs 90.19±8.12 vs 93.75±10.14）。再分別計(jì)算出各例TRPV5條帶和相對(duì)應(yīng)的β-Actin條帶的灰度值的比值，結(jié)果示結(jié)石組的TRPV5表達(dá)低于對(duì)照組，t檢驗(yàn)證明有統(tǒng)計(jì)

12、學(xué)意義（t=6.43>3.355，p<0.01）。
　　 3、熒光定量PCR結(jié)果
　　 依據(jù)熒光定量PCR儀所測(cè)的各CT值（CT值表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。）計(jì)算出各例TRPV5CT值和內(nèi)參照GADPH CT值的比值，t檢驗(yàn)證明結(jié)石組TRPV5mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=5.3

13、4>2.306，p<0.05)，MXPro4.01分析軟件得出相對(duì)定量圖顯示結(jié)石組腎皮質(zhì)TRPV5mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的0.248倍。
　　 五、研究結(jié)論：
　　 A：含鈣腎結(jié)石患者和正常無結(jié)石者的腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)在形態(tài)學(xué)上存在差異，前者存在腎小管上皮細(xì)胞脫落、結(jié)構(gòu)受損，且細(xì)胞膜陽性染色強(qiáng)度更低于后者。
　　 B：TRPV5蛋白在含鈣腎結(jié)石患者的腎組織中表達(dá)低于正常無結(jié)石者。
　　 C：在基因水平，含鈣腎