SaRNA介導(dǎo)的TRPV5激活對(duì)大鼠草酸鈣結(jié)石形成的作用研究.pdf

1、腎結(jié)石為全球性常見疾病之一，可引起持續(xù)性疼痛、血尿、發(fā)熱等癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致腎功能不全，患病率呈逐年增加的趨勢(shì)，且復(fù)發(fā)率高。草酸鈣為最常見的結(jié)石類型，占80％以上。鈣是腎結(jié)石最常見的陽(yáng)離子，高鈣尿是腎結(jié)石形成最主要的危險(xiǎn)因素之一。鈣離子通道蛋白TRPV5主要表達(dá)于腎遠(yuǎn)曲小管及集合管，被認(rèn)為是腎臟對(duì)鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)及重吸收的門控蛋白。TRPV5基因敲除小鼠可出現(xiàn)有意義的鈣漏，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的高鈣尿，表明TRPV5是與高鈣尿相關(guān)的重要基因。RNA激活

2、（RNAa）是由靶向基因啟動(dòng)子的小雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的基因表達(dá)激活，這種小雙鏈RNA被稱為小激活RNA（SaRNA）。在本研究中，我們擬檢驗(yàn)SaRNA介導(dǎo)的TRPV5激活對(duì)大鼠草酸鈣結(jié)石形成的作用。
　　目的:
　　本研究擬篩選出可激活大鼠鈣離子通道蛋白TRPV5表達(dá)的小激活RNA（SaRNA），構(gòu)建其重組慢病毒載體并建立穩(wěn)定激活TRPV5表達(dá)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞株（NRK-52E細(xì)胞株），同時(shí)研究一水草酸鈣晶體（

3、COM）對(duì)TRPV5表達(dá)的影響，最后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)SaRNA介導(dǎo)的TRPV5激活對(duì)大鼠草酸鈣結(jié)石形成的作用。
　　方法:
　　1.我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了5個(gè)靶向大鼠TRPV5基因啟動(dòng)子的SaRNA，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將其轉(zhuǎn)染進(jìn)NRK-52細(xì)胞，通過Western blot篩選可激活TRPV5表達(dá)的SaRNA。
　　2.篩選出的小激活RNA及陰性對(duì)照序列插入慢病毒表達(dá)載體LV3中，然后構(gòu)建重組慢病毒載體；利用產(chǎn)生的慢病毒感

4、染NRK-52E細(xì)胞，然后通過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株，穩(wěn)定細(xì)胞株分別命名為 NRK-control及NRK-TRPV5-SaRNA。
　　3.以不同濃度的一水草酸鈣晶體（COM）處理NRK-52E細(xì)胞，通過Western blot檢測(cè)其對(duì)TRPV5表達(dá)的影響。
　　4.通過輸尿管逆行注射的方式進(jìn)行大鼠慢病毒的感染，通過1%的乙二醇（EG）誘導(dǎo)大鼠草酸鈣結(jié)石的形成，最后通過大鼠24h尿檢測(cè)、血樣本檢測(cè)以及晶體計(jì)數(shù)等方法檢驗(yàn)

5、SaRNA介導(dǎo)的TRPV5激活對(duì)大鼠草酸鈣結(jié)石形成的作用。
　　結(jié)果:
　　1. Western blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，ds-320（合成的5個(gè)SaRNA的其中一個(gè)）可明顯激活TRPV5的表達(dá)，而其他序列對(duì)TRPV5的表達(dá)無(wú)影響。
　　2.與NRK-control穩(wěn)定細(xì)胞株相比，NRK-TRPV5-SaRNA穩(wěn)定細(xì)胞株的TRPV5 mRNA及蛋白的表達(dá)明顯升高。
　　3. COM處理可使NRK-52E細(xì)

6、胞TRPV5的表達(dá)升高，且COM濃度越高時(shí)TRPV5表達(dá)的升高越明顯；此外，ds-320與COM共處理NRK-52E細(xì)胞時(shí)，TRPV5蛋白的表達(dá)高于ds-320或COM單獨(dú)處理。
　　4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組相比，EG+ds-NC組的尿鈣濃度升高，然而與EG+ds-NC組相比，EG+ds-320組的尿鈣濃度下降；與預(yù)期結(jié)果一致，control組無(wú)晶體形成， EG+ds-NC組有大量晶體形成，然而與 EG+ds-NC