TRPV5在腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠腎中的表達及意義.pdf

1、泌尿系結(jié)石是一個全球性的疾病，也是我國最常見的泌尿外科疾病之一。其發(fā)病率高且呈逐年上升趨勢，治療后亦容易復(fù)發(fā)，目前尚不能對其進行有效地預(yù)防。因此，對泌尿系結(jié)石病因的研究，進而預(yù)防泌尿系結(jié)石的形成具有重要的臨床意義。 泌尿系結(jié)石由多因素共同作用所致，其主要的病因包括遺傳、環(huán)境、飲食與代謝等。隨著科學(xué)的發(fā)展，遺傳及代謝成為了近年來的主要研究熱點。鈣是泌尿系結(jié)石成分中最主要的陽離子，草酸鈣結(jié)石占泌尿系結(jié)石中的大多數(shù)，而且含鈣結(jié)石病人中

2、約1/3合并高鈣尿癥。物理化學(xué)研究表明，尿液中的草酸鈣和磷酸鈣的飽和度與尿鈣的濃度有關(guān)，尿鈣增高易于誘發(fā)或促進含鈣尿路結(jié)石的形成。因此，鈣代謝異常導(dǎo)致的高鈣尿在形成泌尿系結(jié)石中的作用越來越引起人們的重視。 尿鈣水平取決于腎小球?qū)︹}的濾過與腎小管對鈣的重吸收。腎小管對鈣的重吸收包括被動重吸收和主動重吸收。被動重吸收的鈣量約占總重吸收鈣量的85％，主要通過近曲小管和髓袢升支的細胞旁緊密連接進行，由Na+-K+ATP泵及水的重吸收產(chǎn)生

3、的電化學(xué)梯度介導(dǎo)。主動重吸收主要發(fā)生在腎遠曲小管和集合管，占總重吸收量的15％。雖然被動重吸收占了總重吸收量的大多數(shù)，但由于被動重吸收不能被特異的調(diào)節(jié)，故對尿鈣水平的影響較少；而主動重吸收，是一種耗能的主動轉(zhuǎn)運，許多尿鈣的調(diào)節(jié)因子均作用于主動重吸收，故主動重吸收對尿鈣水平影響較大，是控制尿鈣水平的主要因素。 TRPV5是瞬時性受體電位通道（TRP）vanilloid受體亞類成員之一，其基因在人類位于7q35染色體，由15個外顯

4、子構(gòu)成，編碼的蛋白大約包含730個氨基酸，組成了6個跨膜區(qū)、一個Ca2+孔區(qū)和位于細胞內(nèi)的氨基端和羧基端。TRPV5的Ca2+孔區(qū)對鈣離子具有高度選擇性，包括4個天冬氨酸殘體（D452），它們共同組成了一個帶負電荷的環(huán)，可作為Ca2+的選擇濾器。近年的研究表明，TRPV5主要在腎遠曲小管和集合管上皮細胞中表達，是介導(dǎo)遠曲小管和集合管對鈣主動重吸收的主要蛋白，在調(diào)控尿鈣水平中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其表達下降或活性降低可能導(dǎo)致尿鈣水平增高。

5、 TRPV5異常能導(dǎo)致高尿鈣，而高尿鈣能促進泌尿系結(jié)石的形成，對此提出疑問——TRPV5異常是不是泌尿系結(jié)石的病因呢?本研究通過免疫組織化學(xué)和實時熒光定量PCR方法測定TRPV5基因及蛋白在大鼠草酸鈣結(jié)石模型腎中的表達，初步探討TRPV5表達在腎結(jié)石形成中的作用，為預(yù)防腎結(jié)石形成提供理論依據(jù)。 研究目的：通過蛋白及基因水平的研究，探討TRPV5表達在腎結(jié)石形成中的作用，為預(yù)防。腎結(jié)石形成提供理論依據(jù)。 研究方法：

6、 1.構(gòu)建大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型：采用含1％乙二醇+1％氯化銨的溶液喂養(yǎng)SD大鼠4周。 2.使用代謝籠收集大鼠24小時尿液，隔日無菌取血。分析大鼠血鈣、尿鈣變化。 3.處死大鼠，無菌取大鼠兩側(cè)腎臟。 4.用一側(cè)腎臟做成石蠟切片，進行HE染色，通過檢測切片中有無結(jié)石結(jié)晶存在來判斷造模是否成功。 5.另取切片進行免疫組化染色，從蛋白水平分析TRPV5蛋白在腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠腎中的表達。 6.使用另一

7、側(cè)腎臟分離出。腎皮質(zhì)，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，從基因水平分析TRPV5 mRNA在腎草酸鈣結(jié)石模型大鼠腎中的表達。 7.統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)。 研究結(jié)果： 1.一般資料：喂養(yǎng)4周后，所有大鼠均存活。實驗結(jié)束時對照組、結(jié)石組大鼠平均體重分別較實驗開始時增加了85.62±17.41g和80.45±19.76g。將每只大鼠實驗結(jié)束時的體重減去實驗開始時的體重得到凈增體重，用t檢驗分析發(fā)現(xiàn)

8、，大鼠增加的體重在兩組間無明顯差異。 2.血、尿生化檢查結(jié)果：兩組大鼠血鈣比較無明顯差異，且均在正常范圍內(nèi)。結(jié)石組大鼠的24小時尿鈣排泄量明顯高于正常組大鼠，約為其2倍（0.74±0.12 v0.39±0.06）。 3.病理檢查結(jié)果：偏光顯微鏡下觀察。腎組織病理切片，結(jié)石組能在腎小管區(qū)觀察到大量結(jié)石結(jié)晶，且多位于腎小管充血、上皮細胞脫落區(qū)域，但正常組大鼠腎病理切片則不能觀察到結(jié)石結(jié)晶。 4.免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果：

9、對兩組大鼠的腎組織進行免疫組化檢查，采用Image-pro plus6.0圖像分析軟件對圖片進行分析，t檢驗結(jié)果顯示結(jié)石組大鼠腎組織的TRPV5蛋白表達水平明顯低于其在正常組大鼠腎組織中的表達水平。 5.熒光定量PCR實驗結(jié)果：根據(jù)熒光定量PCR儀測得的CT值，計算出TRPV5 CT值/GAPDH CT值，使用t檢驗分析，結(jié)果顯示TRPV5 mRNA在結(jié)石組大鼠腎組織中的表達水平明顯低于其在正常組大鼠腎組織中的表達水平。