雌激素調(diào)控破骨細(xì)胞TRPV5表達(dá)的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.雌激素(E2)激活破骨細(xì)胞TRPV5基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域的確定。
　　2.AP-1、SP1和NF-κB介導(dǎo)E2調(diào)控破骨細(xì)胞TRPV5的表達(dá)。
　　方法:
　　1.通過(guò)PCR獲得TRPV5基因包含5'UTR及其上游啟動(dòng)子區(qū)域特定大小的片段，分別為2000bp，1000bp，500bp和150bp，連入pGL3-basic質(zhì)粒，構(gòu)建受小鼠TRPV5基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒Trpv5-2k

2、-luci，Trpv5-1k-luci，Trpv5-500-luci和Trpv5-150-luci，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式，轉(zhuǎn)染Raw264.7細(xì)胞，分析E2刺激前后的熒光素酶表達(dá)活性，尋找出受雌激素調(diào)控的TRPV5基因轉(zhuǎn)錄激活作用最強(qiáng)的區(qū)域。
　　2.構(gòu)建AP-1、SP1和NF-κB的RNAi載體，將AP-1、SP1和NF-κB的RNAi載體分別與Trpv5-500-luci質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Raw264.7細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化

3、，予以E2刺激。
　　(1)觀察E2刺激后Raw264.7細(xì)胞雙熒光素酶活性變化情況。
　　(2)應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)E2刺激后Raw264.7細(xì)胞TRPV5基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。
　　(3)在沉默了NF-κB實(shí)驗(yàn)組中應(yīng)用Western-blot，檢測(cè)E2刺激后Raw264.7細(xì)胞中TRPV5基因的蛋白表達(dá)情況。
　　(4)在沉默了NF-κB實(shí)驗(yàn)組中應(yīng)用ChIP技術(shù)，檢測(cè)E2刺激后Raw264.

4、7細(xì)胞中TRPV5基因的免疫沉淀表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.E2刺激后，轉(zhuǎn)染了熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒Trpv5-2k-luci，Trpv5-1k-luci，Trpv5-500-luci和Trpv5-150-luci后的RAW264.7細(xì)胞，都有較明顯的熒光素酶活性表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示:轉(zhuǎn)染了Trpv5-2k-lucia，Trpv5-1 k-lucib以及Trpv5-500-lucic的Raw264.7細(xì)胞熒光素酶活性明顯高于

5、對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（a:p=0.011，b:p=0.005，c:p=0.002）。轉(zhuǎn)染了Trpv5-150-lucid的Raw264.7細(xì)胞熒光酶素酶活性與對(duì)照組相比也有所升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（d:p=0.415）。組間分析顯示轉(zhuǎn)染Trpv5-150-luci的Raw264.7細(xì)胞的熒光素酶活性與轉(zhuǎn)染Trpv5-2k-lucie，Trpv5-1k-lucif以及Trpv5-500-lucig的Raw264.7細(xì)胞的熒光素酶活性相

6、比，出現(xiàn)了較明顯的降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（e: p=0.08，f:p=0.037，g:p=0.022）。轉(zhuǎn)染Trpv5-2k-lucih，Trpv5-1k-lucii以及Trpv5-500-luci的Raw264.7細(xì)胞，三組之間雙熒光素酶活性的表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(h，i:p=0.641;h，j:p=0.438;i，j:p=0.749)。結(jié)果表明，TRPV5基因啟動(dòng)子在500bp至2000bp范圍內(nèi)都具備完整的啟動(dòng)子活性，但當(dāng)啟動(dòng)子

7、片段截短到150bp時(shí)，熒光素酶活性出現(xiàn)了明顯的降低。說(shuō)明TRPV5基因啟動(dòng)子500bp長(zhǎng)度可能是其具備轉(zhuǎn)錄活性的必備區(qū)段。
　　2.(1)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示:與對(duì)照組相比，沉默轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子AP-1，SP1以及NF-κB后，檢測(cè)到共轉(zhuǎn)染后的RAW264.7細(xì)胞熒光素酶活性均出現(xiàn)了明顯的下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(沉默AP-1，p=0.008;沉默SP1，p=0.006;沉默NF-κB，p=0.001)。組間分析顯示沉默NF-κB雙熒光素

8、酶活性下降最為明顯。結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子AP-1，SP1，NF-κ均參與了E2刺激下破骨細(xì)胞TRPV5的表達(dá)調(diào)控，其中NF-κB在E2調(diào)控破骨細(xì)胞TRPV5的表達(dá)中可能占最主要的作用。
　　(2)對(duì)實(shí)驗(yàn)各組中RAW264.7細(xì)胞TRPV5基因的轉(zhuǎn)錄情況分析顯示:1.正常陽(yáng)性對(duì)照組(E2)TRPV5mRNA表達(dá)明顯，與Mock組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)。說(shuō)明E2能夠有效刺激破骨細(xì)胞TRPV5的轉(zhuǎn)錄。2.實(shí)驗(yàn)組E2+si

9、AP-1*，E2+siSP-1**和E2+siNF-κB***與陽(yáng)性對(duì)照組(E2)相比，三組實(shí)驗(yàn)中TRPV5 mRNA表達(dá)明顯下降，下降程度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（*:p=0.001，**:p=0.000，***:p=0.000），說(shuō)明沉默轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子AP-1、SP1和NF-κB后，在E2刺激下破骨細(xì)胞TRPV5的轉(zhuǎn)錄明顯被抑制，表明轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子AP-1、SP1和NF-κB在E2刺激破骨細(xì)胞TRPV5基因的表達(dá)過(guò)程中均起作用。3.實(shí)驗(yàn)組E2+s

10、iAP-1#，E2+siSP-1##和E2+siNF-κ B###與Mock組相比，TRPV5 mRNA相對(duì)較明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(#:p=0.001，##:p=0.000，###:p=0.000)，說(shuō)明在特異性沉默其中某一個(gè)轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子后，另外兩個(gè)轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子仍起作用，進(jìn)一步說(shuō)明AP-1、SP1和NF-κB在E2刺激破骨細(xì)胞TRPV5基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)中均起作用。
　　(3)Western-blot檢測(cè)顯示:1.E2實(shí)驗(yàn)組中TRP

11、V5蛋白的電泳條帶均勻單一，與Mock比較顯得較寬較長(zhǎng)，說(shuō)明E2能夠有效的刺激破骨細(xì)胞TRPV5蛋白的表達(dá)。2.在E2+siNF-κB實(shí)驗(yàn)組中，沉默轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子NF-κB后，蛋白電泳條帶清晰，分布均勻，與Mock組相比條帶較寬長(zhǎng)，但和E2+siNC及E2組比條帶則較窄短。說(shuō)明TRPV5的蛋白表達(dá)在E2+siNF-κB實(shí)驗(yàn)組中較Mock組多，但比E2+siNC和E2組少。表明轉(zhuǎn)錄結(jié)合參與NF-κB被特異性的沉默后，TRPV5基因的蛋白表達(dá)

12、量出現(xiàn)了下降，但仍存在其他如AP-1，SP1等轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)參與介導(dǎo)E2調(diào)控破骨細(xì)胞TRPV5基因的蛋白表達(dá)。
　　(4)ChIP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示:E2+siNF-κB組與Mock組相比較，其條帶更寬，視野更透亮，但和E2+siNC組及E2組相比電泳條帶卻較窄，視野也較暗。說(shuō)明E2+siNF-κB組TRPV5基因的免疫沉淀表達(dá)量，較Mock組多，但比E2+siNC和E2組少。結(jié)果說(shuō)明沉默轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子NF-κB后，能夠與TRPV5基因有效

13、結(jié)合的位點(diǎn)明顯減少，導(dǎo)致TRPV5基因的免疫沉淀表達(dá)量明顯降低，但仍存在其他轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)如AP-1，SP1等能參與介導(dǎo)E2調(diào)控破骨細(xì)胞TRPV5基因的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.TRPV5基因啟動(dòng)子在500bp至2000bp范圍內(nèi)具備完整的啟動(dòng)子活性，其中基因啟動(dòng)子500bp范圍內(nèi)可能具備基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)所需要的大部分轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。
　　2.AP-1、SP1和NF-κB在雌激素調(diào)控TRPV5的轉(zhuǎn)錄激活中均起作用，其中NF-