TRPV4在大鼠睪丸組織中的表達(dá).pdf

1、在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中，鈣離子是觸發(fā)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵信息分子和必經(jīng)途徑，而細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子濃度受細(xì)胞膜鈣離子通道的調(diào)控。最新有關(guān)細(xì)胞膜鈣離子通道的研究提示：細(xì)胞膜鈣離子通道被激活引起的鈣內(nèi)流是觸發(fā)細(xì)胞增殖的必經(jīng)途徑；非電壓依賴性鈣通道瞬時受體電位（Transient Receptor Potential，TRP）具有調(diào)節(jié)細(xì)胞存活/生長/死亡等功能． 在TRP介導(dǎo)的眾多功能和疾病中，它在細(xì)胞增殖中的作用尤為突出，這在許多組織和細(xì)胞，已經(jīng)有實驗

2、結(jié)果的支持。例如，肺動脈平滑肌細(xì)胞的TRPC1和TRPC6表達(dá)顯著增高，它們的所介導(dǎo)的鈣內(nèi)流刺激平滑肌細(xì)胞的增殖，最終導(dǎo)致肺動脈高壓的發(fā)生；血管內(nèi)皮來源的生長因子（VEGF）通過激活內(nèi)皮細(xì)胞的TRP通道，引起鈣內(nèi)流，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，可導(dǎo)致腫瘤新生血管的生成；TRPM1的表達(dá)與黑色素瘤的惡性程度密切相關(guān)；這些結(jié)果均表明，TRP在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖中具有不容忽視的作用。 目前不少研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，TRP基因家族的多個亞型在睪丸上有表達(dá)

3、，部分還是高表達(dá)。然而，關(guān)于這方面的研究還是很少，因此有必要對此進(jìn)行研究。上述在睪丸附睪上的研究都是僅限于是否表達(dá)的問題，既然TRP家族在睪丸上的表達(dá)如此豐富，其在睪丸上有何功能就變成了現(xiàn)在應(yīng)該關(guān)心的，而目前國際上的研究尚沒有相關(guān)的研究報道。 目前國際上的研究表明：TRPV4大量表達(dá)于腎遠(yuǎn)曲小管的上皮組織，也少量表達(dá)于心、肝、肺、脾、睪丸及許多其他組織。盡管功能方面的研究已經(jīng)取得了不少成果，如：TRPV4在氣管平滑肌細(xì)胞的表達(dá)可

4、能涉及到氣道的高反應(yīng)性，如哮喘；TRPV4在柯蒂氏器的表達(dá)可能提示感覺神經(jīng)性的聽力損害；TRPV4與母羊的溫度改變引起的排尿反射有關(guān)。但是TRPV4在睪丸上的功能至今未有報導(dǎo)。研究其與睪丸的關(guān)系將具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的發(fā)展前景。因此，研究TRPV4與睪丸上的分布以及功能是具有很大意義的。為此，我們通過動物實驗對TRPV4通道與睪丸組織的關(guān)系進(jìn)行初步研究。 目的: 研究TRP基因亞家族成員TRPV4在大鼠睪丸組織中的表

5、達(dá)。探討TRP基因家族在睪丸上的表達(dá)，為睪丸組織上TRPV4功能的研究奠定基礎(chǔ)。 方法: 第一部分常規(guī)RT-PCR檢測TRPV4在大鼠睪丸組織中mRNA的表達(dá) 1． TRPV4基因引物的設(shè)計 登陸TRPV4大鼠的genebank，采用Primer Premer5．0軟件自行設(shè)計引物。 2．總RNA提取及cDNA的合成 氯仿吸入處理大鼠，處理后大鼠處于昏迷狀態(tài)，采集睪丸組織，立即投到液氮中保

6、存。取100m睪丸組織，按照分子克隆常用方法Trizol法提取細(xì)胞總RNA；然后用DNaseI在37℃消化30min，以除去可能存在的DNA污染。核酸/蛋白質(zhì)定量分光光度計測定其A260及A280。對于A260/A280大于18而小于20的RNA樣本，取1ug總RNA，按照試劑說明書合成cDNA。 3．RT-PCR 以第一鏈為模板，按以下條件擴(kuò)增：94℃10min，94℃45s，55℃45s，72℃1min，30cycl

7、es，94℃1min，60℃1min，72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物行0．7%瓊脂糖電泳。凝膠成像分析儀分析。 第二部分免疫組織化學(xué)染色檢測TRPV4蛋白在大鼠睪丸組織中的表達(dá) 1．購買TRPV4單克隆抗體和SABC免疫組化試劑盒TRPV4的單克隆抗體。 2．標(biāo)本獲取及處理： 氯仿吸入處理大鼠，處理后大鼠處于昏迷狀態(tài)，采集睪丸組織，投入福爾馬林溶液中固定，經(jīng)階梯脫水、二甲苯透明及浸蠟后，石蠟包埋組織。

8、 3．免疫組織化學(xué)染色 采用SABC方法，所有組織標(biāo)本以厚度4μm連續(xù)切片3張，按照試劑說明書操作，采用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。以胞漿呈棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。 第三部分Western blot檢測TRPV4蛋白在大鼠睪丸組織中的表達(dá) 1．標(biāo)本獲取及處理 氯仿吸入處理大鼠，處理后大鼠處于昏迷狀態(tài)，采集睪丸組織，用蛋白提取液提取蛋白，用預(yù)冷的PBS洗2次，去上清，加4×SDS凝膠上樣緩沖液，

9、沸水浴變性10min。 2．Western blot 常規(guī)制備SDS-PAGE凝膠，點兩組相同樣品，120V電泳約3．5h后，切下其中一組按常規(guī)方法固定、考馬斯亮藍(lán)R-250染色和脫色，作為判斷Western blot的依據(jù)。另一組樣品切膠轉(zhuǎn)膜，硝酸纖維素膜按凝膠大小剪裁，并頭尾做好標(biāo)記，兩側(cè)各置濾紙3張，按膠負(fù)膜正放置，4℃、18V轉(zhuǎn)膜過夜。取出膜，用封閉液封閉至少2h，TBS液洗膜3次，每次10min；加入1：100

10、稀釋的一抗，4℃作用2h； TBS液洗膜3次，每次10min；加入1：5000稀釋的羊抗兔IgG二抗，室溫作用1h； TBS液洗膜3次，每次10min；用反射顯影技術(shù)觀察條帶。用Gel Logia200成像系統(tǒng)攝像并分析。 結(jié)果: 第一部分常規(guī)RT-PCR檢測TRPV4在大鼠睪丸組織中mRNA的表達(dá) 在紫外透射儀下，TRPV4的泳道在標(biāo)準(zhǔn)核酸分子質(zhì)量附近出現(xiàn)1條特異性擴(kuò)增條帶，片段大小約為237 bp左右，圖像分

11、析表明產(chǎn)物純度較高，無非特異性帶干擾。 第二部分免疫組織化學(xué)染色檢測TRPV4蛋白在大鼠睪丸組織中的表達(dá) 顯微鏡下可見TRPV4陽性片中，棕色抗原抗體復(fù)合物多沉積于睪丸組織中較成熟的生精細(xì)胞和部分支持細(xì)胞的細(xì)胞核；在TRPV4陰性片中未見棕色抗原抗體復(fù)合物沉積。 第三部分Western blot檢測TRPV4蛋白在大鼠睪丸組織中的表達(dá) 用Gel Logia200成像系統(tǒng)攝像后，圖片顯示：在試驗泳道中，在3

12、6KDa和871KDa處可見明顯的陽性條帶，而在陰性對照泳道中，僅在36KDa處見到陽性條帶，可以確定大鼠睪丸組織中有GAPDH蛋白和TRPV4蛋白表達(dá)，GAPDH蛋白作為內(nèi)參。 結(jié)論: TRPV4在睪丸組織上有表達(dá)，主要表達(dá)在較成熟的生精細(xì)胞和支持細(xì)胞上，呈強(qiáng)表達(dá)，這探討TRP基因家族在睪丸上的表達(dá)做了補(bǔ)充，同時也為睪丸組織上TRPV4功能的研究奠定了基礎(chǔ)。研究其與睪丸的關(guān)系將具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的發(fā)展前景，將開辟