人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化相關(guān)性microRNA的篩選.pdf

1、目的：通過檢測人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）及其誘導(dǎo)分化的軟骨細(xì)胞中miRNA基因的表達(dá)譜，篩選出誘導(dǎo)分化前后差異表達(dá)的miRNAs，尋找可能的人BMSCs向軟骨分化過程中具有調(diào)控作用的miRNAs，為進(jìn)一步闡明miRNA在BMSCs軟骨分化過程中的作用和意義提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法：（1）利用密度梯度離心法自人骨髓中分離BMSCs，在體外擴(kuò)增傳代培養(yǎng)，通過對其形態(tài)特點的觀察及細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測，對培養(yǎng)的人BMSCs進(jìn)行鑒定。（

2、2）采用體外細(xì)胞團(tuán)三維培養(yǎng)方法，用含有TGF-β1、地塞米松、胰島素、牛血清白蛋白和維生素C的培養(yǎng)液誘導(dǎo)人BMSCs向軟骨細(xì)胞方向分化，通過甲苯胺藍(lán)、s-100蛋白免疫組織化學(xué)染色對誘導(dǎo)分化的軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。（3）利用miRNA基因芯片技術(shù)，檢測人BMSCs及其誘導(dǎo)分化的軟骨細(xì)胞miRNAs的表達(dá)譜，通過SAM軟件分析篩選出人BMSCs和其分化的軟骨細(xì)胞之間表達(dá)差異性的miRNAs。（4）采用實時定量PCR方法對篩選出的差異表達(dá)的mi

3、RNA基因進(jìn)行驗證并預(yù)測其潛在的靶基因。
　　結(jié)果：（1）經(jīng)骨髓分離培養(yǎng)所得到的細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果為：細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44為陽性，CD34、CD45為陰性，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征。（2）人BMSCs經(jīng)TGF-β1、地塞米松、胰島素、牛血清白蛋白和維生素C誘導(dǎo)21天后，甲苯胺藍(lán)、s-100蛋白免疫組織化學(xué)染色均陽性，符合軟骨細(xì)胞的特征。（3）用miRNA基因芯片檢測了兩組樣品中人BMSCs及其誘導(dǎo)分化的軟骨

4、細(xì)胞miRNAs的表達(dá)譜，并篩選出了在該兩種細(xì)胞中表達(dá)的差異性的miRNAs。在兩組樣品中，軟骨細(xì)胞較BMSCs高表達(dá)的miRNAs分別為：26個、7個（兩組共同存在的為5個）；軟骨細(xì)胞較BMSCs低表達(dá)的miRNAs在兩組樣品中分別為：1個、2個（兩組共同存在的為0個）。（4）針對篩選出的4個在軟骨中高表達(dá)的miRNAs利用實時定量PCR的方法在第3組樣品中進(jìn)行驗證，結(jié)果均與芯片檢測的結(jié)果一致。
　　結(jié)論：（1）用密度梯度離心法