大鼠脂肪間充質干細胞和骨髓間充質干細胞成骨分化比較的體外研究.pdf

1、第一章大鼠骨髓間充質干細胞和脂肪間充質干細胞的提取與培養(yǎng) 目的：分離大鼠骨髓間充質干細胞和脂肪間充質干細胞，比較兩種細胞的特征，為脂肪間充質干細胞可替代骨髓基質細胞做為種子細胞提供依據。 方法：利用細胞貼壁性對骨髓間充質干細胞和脂肪間充質干細胞進行分離，比較兩種細胞的情況，包括(1)單位質量組織獲得兩種細胞的量、(2)細胞形態(tài)、(3)細胞貼壁率、(4)細胞動力學、(5)細胞表面標記。并對數據進行分析。 結果：(1

2、)單位質量組織獲得骨髓間充質干細胞數量為(2.23±0.35)×10<'5>／g，脂肪間充質干細胞為(2.66±0.75)×10<'5>／g，采用成組設計兩樣本比較的t檢驗，t=-1.446，P=0.179>0.05，尚不能認為兩者有差異，可以認為在單位質量骨髓和脂肪組織中獲得的骨髓間充質干細胞和脂肪間充質干細胞數量相當。(2)兩種細胞形態(tài)均為條索樣，呈成纖維細胞形態(tài)。(3)應用直線相關分析考察兩組細胞的貼壁率之間的關系，相關系數，r=

3、0.999，決定系數r<'2>=0.997，可以認為兩貼壁率之間有直線相關關系，可以認為在不同的時間點兩種細胞的貼壁率相似，并且有共同遞增趨勢。(4)脂肪間充質干細胞的增殖能力與骨髓間充質干細胞相當，消化后的第2、5代細胞經歷24～48小時的潛伏期后，進入6～9天的對數生長期，然后過渡到平臺期。(5)通過流式實驗和免疫細胞化學顯示，骨髓間充質干細胞和骨髓間充質干細胞表面表達CD29、CD44，不表達CD34。 結論：(1)自大鼠

4、脂肪中可提取出與骨髓間充質干細胞類似的脂肪間充質干細胞。(2)脂肪間充質干細胞的表面標記與骨髓間充質干細胞類似。 第二章 骨髓間充質干細胞和脂肪間充質干細胞成骨誘導的比較 目的:對骨髓間充質干細胞和脂肪間充質干細胞成骨能力進行比較,為脂肪間充質干細胞替代骨髓間充質干細胞成為骨組織工程的種子細胞提供依據。 方法:應用倒置顯微鏡觀察細胞誘導后的變化;骨髓間充質干細胞和脂肪間充質干細胞誘導后用鈣鈷法染色、四環(huán)素

5、熒光標記、I型膠原染色、茜素紅染色、堿性磷酸酶測定、RT-PCR檢測骨鈣素mRNA表達等方法,脂肪間充質干細胞誘導前后透射電鏡觀察細胞變化,對間充質干細胞誘導成骨的機制進行探討。 結果:骨髓間充質干細胞和脂肪間充質干細胞誘導后細胞逐漸出現突起,胞漿內出現分泌性顆粒。兩種細胞誘導3周后,茜素紅染色出現淡紅色鈣結節(jié);四環(huán)素熒光染色出現明亮黃色熒光鈣結節(jié)。改良鈣鈷法染色,細胞胞漿中出現黑色顆粒。兩種細胞誘導后堿性磷酸酶(ALP)定量檢

6、測,對于兩組不同來源細胞誘導后的ALP值進行等級相關分析,Spearman相關系數γ<,s>=0.946,P<0.001,可以認為兩組之間有直線相關關系,ALP值隨時間的增加而共同遞增。脂肪間充質干細胞誘導2周后,通過投射電鏡觀察,對其進行誘導前后比較,誘導后的脂肪間充質干細胞明顯增大,表面的絨毛突起減少,胞核不明顯,胞漿中的細胞器發(fā)達,內質網擴張明顯。通過RT-PCR檢測兩種細胞誘導2周后的骨鈣素(BGP)mRNA表達,兩組BGP的m

7、RNA表達比較無顯著性差異。 結論:(1)骨髓間充質干細胞可向成骨方向誘導分化。(2)脂肪間充質干細胞向成骨誘導后，可表達I型膠原、ALP、BGP，并出現鈣結節(jié)。(3)AMSCs經過誘導后，可向成骨細胞方向分化。(4)AMSCs與bMSCs成骨能力無顯著性差異。(5)AMSCs可替代bMSCs做為骨組織工程的種子細胞。 第三章 脂肪間充質干細胞接種載體成骨分化的研究 目的：脂肪間充質干細胞可與羥基磷灰石復

8、合向成骨細胞分化，檢測兩種羥基磷灰石復合細胞成骨能力的差別。 方法：通過掃描電鏡觀察脂肪間充質干細胞與普通羥基磷灰石和納米級羥基磷灰石復合情況。檢測細胞與載體復合后，表達堿性磷酸酶和骨鈣素的情況。 結果：在將AMSCs細胞種植于兩種HA載體表面，向成骨方向誘導4周后，通過掃描電鏡觀察，HA載體表面有細胞存在。普通羥基磷灰石組ALP值為9.782±2.085金氏U/100ml，納米級羥基磷灰石組ALP值為11.771±3.

9、091金氏U/100ml，并且在兩種不同的羥基磷灰石(HA)的表達有顯著性差異(P=0.041<0.05)。BGP的檢測發(fā)現，在AMSCs細胞種植誘導2周后，在兩種載體上均有BGP的表達，并且在納米級羥基磷灰石上的表達要高于普通級羥基磷灰石。 結論：(1)脂肪間充質干細胞(AMSCs)可在載體上復合生長。(2)AMSCs與HA載體復合后，可表達成骨細胞的特征。(3)誘導成骨后，在納米級羥基磷灰石上復合表達堿性磷酸酶的量高于普通級