版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、前言
由關(guān)節(jié)炎和創(chuàng)傷等原因造成的軟骨缺損及功能障礙是臨床上面臨的難題之一[1]。利用軟骨組織工程的方法再造軟骨治療軟骨損傷,在臨床上具有良好的應(yīng)用前景[2]。臨床中,如何能盡快地形成新的骨組織至關(guān)重要,不僅可以縮短骨折愈合的時(shí)間,也為盡快地恢復(fù)骨的功能打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。因此,要首先了解軟骨細(xì)胞形成的相關(guān)機(jī)制,以及影響軟骨細(xì)胞形成的相關(guān)因子和信號(hào)通路。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmesenchymalste
2、mcells,BMSCs)是一類具有潛在多分化能力的成體干細(xì)胞,可以在體內(nèi)及體外誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等不同類型細(xì)胞[3,4]。此外,BMSCs具有極強(qiáng)的自我修復(fù)能力,獲取簡(jiǎn)單、增殖力強(qiáng)、來源廣泛、免疫原性弱[5]、自體移植不發(fā)生排斥反應(yīng)[6]、不涉及倫理等特點(diǎn),成為組織細(xì)胞工程研究的熱點(diǎn)。
Wnt蛋白是一類高度保守的分泌型糖蛋白,其作為信號(hào)因子參與了包括生長(zhǎng)、發(fā)育和凋亡在內(nèi)的眾多進(jìn)程[7]。Wnt通過作用于細(xì)胞膜上的受
3、體,進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),從而調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路受體LRP5發(fā)生功能缺失突變后會(huì)造成骨質(zhì)疏松的表型,表明Wnt信號(hào)通路在骨形成過程中起重要作用[8]。有研究表明,在小鼠肢體發(fā)育及軟骨分化過程中檢測(cè)到了多種Wnt基因的表達(dá)[9]。Wnt3a可以促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞增殖并抑制其分化為成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞[10,11]。Wnt5a調(diào)控軟骨細(xì)胞的形成,Wnt5b抑制軟骨細(xì)胞的分化[12,13]。在間質(zhì)凝結(jié)(mes
4、enchymalcondensations)中過表達(dá)Wnt1,Wnt7a或者Wnt14會(huì)抑制其分化為軟骨細(xì)胞[14-16]。上述研究表明Wnt信號(hào)通路可能在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞分化方面起重要作用。最近有報(bào)道發(fā)現(xiàn)Wnt11可以在軟骨細(xì)胞中誘導(dǎo)Ⅱ型膠原蛋白(typeⅡcollagen)的表達(dá)[17]。Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)量的增加是間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的標(biāo)志事件之一,這表明Wnt11可能在調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過程中起重要作用。此外,X
5、u等人的研究發(fā)現(xiàn)在三維藻朊酸鹽凝膠上誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的過程中Wnt11基因在誘導(dǎo)分化的中后期階段高表達(dá)[18]。
生長(zhǎng)因子在BMSCs定向分化為軟骨細(xì)胞的過程中起到了非常關(guān)鍵的作用,已有學(xué)者研究得出,TGF-β1能夠誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化[19,20]。TGF-β1在誘導(dǎo)BMSCs轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞的過程中,對(duì)軟骨細(xì)胞的分化和功能具有雙向調(diào)節(jié)作用,可以促進(jìn)未分化或分化早期的軟骨細(xì)胞DNA合成、增殖、分化及細(xì)胞
6、外基質(zhì)的合成,抑制成熟軟骨細(xì)胞的增殖和分化。這種雙向調(diào)節(jié)作用與TGF-β1的濃度密切相關(guān),有研究表明[21,22],不同濃度的TGF-β1可能通過影響B(tài)MP-2,進(jìn)而影響B(tài)MSCs向軟骨細(xì)胞的分化,濃度過低,不足以引發(fā)BMP-2的表達(dá),不能誘導(dǎo)軟骨的形成,濃度過高,則導(dǎo)致BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的潛能下降,不利于誘導(dǎo)分化。
JNK通路是MAPK通路家族的三大主要成員之一,目前已發(fā)現(xiàn)三種,分別由三個(gè)基因編碼,JNK1、JNK2、
7、JNK3。該途徑的特點(diǎn)之一是可被多種應(yīng)激因素激活,,也可被多種類型的細(xì)胞表面受體激活。相對(duì)于ERK途徑,就目前的研究,對(duì)JNK途徑在MSCs分化中的作用及其在軟骨細(xì)胞增殖和分化過程中的作用還不是十分明確。有學(xué)者經(jīng)研究得出IL-17通過JNK途徑誘導(dǎo)MMP13和aggrecanase的表達(dá)從而引起關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)的降解[23]。
蛋白激酶C(PKC)屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,廣泛分布于機(jī)體各器官、組織和細(xì)胞中,是肌醇磷脂信號(hào)
8、通路的中心環(huán)節(jié)。DelCarol[24]等研究認(rèn)為激活PKCβ1通路,結(jié)果導(dǎo)致軟骨細(xì)胞死亡,若添加特異性PKCβ1抑制劑,可完全抑制軟骨細(xì)胞死亡。Ciarmatori[25]等研究認(rèn)為,PKC信號(hào)通路與多種信號(hào)通路一起參與了誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的增殖和早期分化過程。以上的研究表明,PKC作為重要的信號(hào)因子,參與調(diào)解軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等多種生物學(xué)效應(yīng),但尚缺乏具體機(jī)制。
本研究擬采用大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象,通過慢病毒介導(dǎo)的
9、轉(zhuǎn)基因技術(shù),將Wnt11轉(zhuǎn)染入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,結(jié)合體外誘導(dǎo)軟骨形成等實(shí)驗(yàn),在TGF-β1存在的條件下,加入或不加入JNK和PKC抑制劑,探討TGF-β1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過程中的協(xié)同作用。
材料和方法
一、實(shí)驗(yàn)材料
1、主要試劑
DMEM培養(yǎng)基(Gibco,美國)
PBS(Hyclone,美國)
FBS(Hyclone,美國)
胰酶(Hyclone,美
10、國)
HISTOPAQUE-1083(Sigma,美國)
MTT(Sigma,美國)
DMSO(Sigma,美國)
細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(Hyclone,美國)
Polybrene(Sigma,美國)
引物(生工,中國)
PCR試劑盒(Hyclone,美國)
多聚甲醛(Hyclone,美國)
Cy3標(biāo)記山羊抗兔(Hyclone,美國)
tr
11、itonX100(Hyclone,美國)
山羊血清(Hyclone,美國)
DAPI(Sigma,美國)
Wnt11(Santa,美國)
COL2A1(Santa,美國)
Wnt11抗體(Santa,美國)
Ⅱ型膠原多克隆抗體(Santa,美國)
Aggrecan抗體(Santa,美國)
BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Hyclone,美國)
預(yù)染蛋白分
12、子量標(biāo)準(zhǔn)(Fermentas,加拿大)
TGF-β1(Hyclone,美國)
JNK抑制劑(Hyclone,美國)
PKC抑制劑(Hyclone,美國)
成軟骨誘導(dǎo)液(Hyclone,美國)
阿爾新藍(lán)(Hyclone,美國)
2、主要儀器
倒置相差顯微鏡(OLYMPUS,日本)
CO2培養(yǎng)箱(力申,中國)
超凈工作臺(tái)(安泰,中國)
流式細(xì)
13、胞儀(BD,美國)
酶標(biāo)儀(BIOTEK,美國)
紫外分光光度計(jì)(Thermo,美國)
熒光定量PCR儀(Thermo,美國)
激光共聚焦掃描顯微鏡(OLYMPUS,日本)
雙垂直蛋白電泳儀(BD,美國)
凝膠成像系統(tǒng)(Thermo,美國)
二、實(shí)驗(yàn)方法
1、SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
采用密度梯度離心法從大鼠后臀的脛骨和股骨骨髓腔
14、中分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面的CD34,CD45,CD44和CD29等進(jìn)行鑒定。
2、構(gòu)建Wnt11慢病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
細(xì)胞分為Wnt11+eGFP基因轉(zhuǎn)染組,慢病毒空載體轉(zhuǎn)染組,未轉(zhuǎn)染對(duì)照組,以熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
3、檢測(cè)細(xì)胞的Wnt11表達(dá)水平
在2中的三組細(xì)胞中加入Wnt11抗體,分別以免疫熒光法、實(shí)時(shí)定量PCR法
15、和westernblot法檢測(cè)2中細(xì)胞的Wnt11表達(dá)水平。
4、檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況
利用MTT法檢測(cè)2中的三組細(xì)胞的增殖情況。
5、檢測(cè)Aggrecan和CollagenⅡ的表達(dá)水平
在2中的三組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中加入軟骨細(xì)胞標(biāo)志基因Aggrecan和CollagenⅡ抗體,分別以實(shí)時(shí)定量PCR法和westernblot法檢測(cè)Aggrecan和CollagenⅡ的表達(dá)水平,再利用免疫組化檢測(cè)上述
16、三組細(xì)胞中CollagenⅡ的表達(dá)情況。
6、TGF-β1對(duì)體外誘導(dǎo)軟骨形成實(shí)驗(yàn)的研究
將2中的三組細(xì)胞分別在加入或不加入TGF-β1情況下進(jìn)行體外誘導(dǎo)軟骨形成實(shí)驗(yàn),進(jìn)行阿爾新藍(lán)染色,并測(cè)定OD590處的吸光值;利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Aggrecan,CollagenⅡ及軟骨形成調(diào)控基因Sox9,RUNX2和Ihh的表達(dá)水平。
7、抑制劑對(duì)體外誘導(dǎo)軟骨形成實(shí)驗(yàn)的研究
TGF-β1存在的情況下,在培
17、養(yǎng)基中分別加入JNK抑制劑SP600125和PKC抑制劑GF109203X,進(jìn)行體外誘導(dǎo)軟骨形成實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)三組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化形成的軟骨細(xì)胞中Aggrecan和CollagenⅡ表達(dá)量的變化情況。
結(jié)果
1、SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
流式細(xì)胞儀檢測(cè)得出CD34、CD45、CD44、CD29的陽性表達(dá)率分別為3.25%、4.25%、95.73%、93.71%,證實(shí)所分離培養(yǎng)
18、的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
2、Wnt11慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BMSC后細(xì)胞生長(zhǎng)良好,轉(zhuǎn)染效率提高
Wnt11慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的BMSC中,熒光顯微鏡下觀察得出細(xì)胞生長(zhǎng)良好,轉(zhuǎn)染效率提高。
3、Wnt11慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BMSC后,Wnt11表達(dá)上調(diào)
Wnt11慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的BMSC中,免疫熒光法、實(shí)時(shí)定量PCR法和westernblot法檢測(cè)得出Wnt11的表達(dá)上調(diào),明顯高于慢病毒空載體
19、轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組。
4、Wnt11慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BMSC后抑制細(xì)胞的增殖
三組細(xì)胞均在第四天增殖能力達(dá)到峰值,Wnt11+eGFP基因轉(zhuǎn)染組的BMSC的OD值小于其他兩組,說明通過Wnt11慢病毒轉(zhuǎn)染抑制了BMSC的增殖。
5、Wnt11慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BMSC后,Aggrecan和CollagenⅡ表達(dá)水平上調(diào)
在加入軟骨細(xì)胞標(biāo)志基因Aggrecan和CollagenⅡ抗體后,實(shí)時(shí)定量
20、PCR法和westernblot法檢測(cè)得出,基因轉(zhuǎn)染組BMSC的Aggrecan和CollagenⅡ表達(dá)水平上調(diào),其他兩組無明顯差異。另外,免疫組化檢測(cè)得出基因轉(zhuǎn)染組BMSC的CollagenⅡ呈陽性表達(dá),細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色,其他兩組無明顯變化。
6、TGF-β1可以促進(jìn)BMSC體外誘導(dǎo)軟骨形成
三組BMSC在加入TGF-β1的情況下,經(jīng)阿爾新藍(lán)染色得出,OD590的值要明顯高于未加入TGF-β1的BMSC。Real-t
21、imePCR檢測(cè)得出,加入TGF-β1的情況下,Aggrecan、CollagenⅡ及軟骨形成調(diào)控基因Sox9,、RUNX2和Ihh的表達(dá)上調(diào),明顯高于未加入TGF-β1的BMSC。
7、JNK和PKC抑制劑可以抑制BMSC體外誘導(dǎo)軟骨形成
在TGF-β1存在的情況下,經(jīng)Real-timePCR檢測(cè)得出,加入JNK抑制劑SP600125和PKC抑制劑GF109203X的BMSC,Aggrecan、CollagenⅡ的
22、表達(dá)下調(diào),明顯低于未加入抑制劑組BMSC。
結(jié)論
1、BMSC經(jīng)Wnt11慢病毒載體轉(zhuǎn)染后,抑制BMSC的增殖,Aggrecan和CollagenⅡ的表達(dá)水平上調(diào),可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
2、在經(jīng)Wnt11慢病毒載體轉(zhuǎn)染后的BMSC中加入TGF-β1,可以使軟骨標(biāo)志性基因Aggrecan、CollagenⅡ及軟骨形成調(diào)控基因Sox9,、RUNX2和Ihh的表達(dá)上調(diào),促進(jìn)BMSC體外誘導(dǎo)軟骨形成。
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向氣管軟骨細(xì)胞分化的研究.pdf
- 體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨樣細(xì)胞分化的研究.pdf
- 疏密波誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的研究.pdf
- 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 力學(xué)刺激對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的研究.pdf
- 力學(xué)作用對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化影響的研究.pdf
- 消痹靈體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的觀察.pdf
- 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- Wnt3a蛋白調(diào)控大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的研究.pdf
- 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化過程中microRNA 130a作用的研究.pdf
- 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究.pdf
- Nucleostemin在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的研究.pdf
- 誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化.pdf
- EMILIN3基因促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及向軟骨細(xì)胞分化.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論