microRNA-1調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：和意義:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是來源于骨髓的能向多種細(xì)胞分化的多潛能干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明MSCs能分化為心肌細(xì)胞fcardiomyocytes,CMs),MSCs移植于受損心臟,心功能得到改善。但研究亦發(fā)現(xiàn),MSCs體內(nèi)移植橫向分化為心肌細(xì)胞效率低,修復(fù)受損心臟效果有限。因此促進(jìn)MSCs向CMs分化,提高其分化效率,是優(yōu)化MSCs治療缺血性心臟病迫切需要解決的問題。microRNAs

2、(miRNAs)是一類由基因組編碼、高度保守的18-22個堿基長度的非編碼RNAs。它通過降解mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯而調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA-1是新近發(fā)現(xiàn)的在心臟發(fā)育、肌分化過程中起重要調(diào)控作用的肌特異性miRNA。研究表NmiRNA-1能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)、心臟祖細(xì)胞向CMs分化,誘導(dǎo)HeLa、C2C12細(xì)胞向肌細(xì)胞分化。miRNA-1能否調(diào)控MSCs向心肌樣細(xì)胞分化目前尚不清楚

3、。本研究通過構(gòu)建大鼠miRNA-1真核表達(dá)載體,檢測miRNA-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSCs后心肌相關(guān)基因的表達(dá)。探討miRNA-1調(diào)控MSCsN心肌樣細(xì)胞分化的影響。為提高M(jìn)SCs向心肌細(xì)胞分化的效率,優(yōu)化MSCs治療缺血性心臟病提供新靶點(diǎn)。
　　 方法：應(yīng)用PCR技術(shù)體外合成pre-miRNA-1對應(yīng)的基因組片段,定向克隆到pSD11-U6/Neo/GFP載體上,構(gòu)建大鼠miRNA-1真核表達(dá)載體。分離擴(kuò)增培養(yǎng)及鑒定大鼠MSCs。脂質(zhì)

4、體法轉(zhuǎn)染大鼠第四代MSCs,實(shí)時定量RT-PCR(quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)檢測MSCs轉(zhuǎn)染miRNA-1質(zhì)粒后miRNA-1的表達(dá)。分別于轉(zhuǎn)染2、4、6天后:RT-PCR檢測心肌重要轉(zhuǎn)錄因子GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表達(dá),免疫熒光檢測心肌特異蛋白Ⅰ(cardiactroponin-Ⅰ,cTnI)的表達(dá)。
　　 結(jié)果： PCR鑒定及DNA測序表明,miRNA-

5、1真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。體外培養(yǎng)的大鼠第四代MSCs,細(xì)胞形態(tài)均一,呈長梭形生長。免疫熒光結(jié)果顯示90％以上的MSCs表達(dá)整合素家族成員CD29、黏附分子CD44；不表達(dá)造血前體細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34、白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45,符合MSCs特征。轉(zhuǎn)染miRNA-1質(zhì)粒48 h后,20-30％的MSCs表達(dá)GFP,qRT-PCR結(jié)果顯示MSCs的miRNA-1表達(dá)明顯上調(diào)。RT-PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miRNA-1質(zhì)粒后,GATA4、NKx2.5

6、、MEF2C的表達(dá)隨時間逐漸增強(qiáng)。免疫熒光結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA-14、6天后可見cTnI陽性表達(dá)細(xì)胞。MSCs和空質(zhì)粒對照組:RT-PCR結(jié)果顯示無GATA4、NKx2.5表達(dá),MEF2C表達(dá)無明顯變化；免疫熒光未見cTnI陽性表達(dá)細(xì)胞。
　　 結(jié)論： miRNA-1質(zhì)粒載體構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)染miRNA-1質(zhì)粒后MSCs的miRNA-1表達(dá)水平明顯上調(diào)；miRNA-1具有促進(jìn)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化的重要作用,為MSCs移植治療缺