MicroRNA‐145在間充質干細胞成軟骨分化中的作用及機制研究.pdf

1、軟骨缺損一直是外科修復治療的難題，組織工程學能夠結合細胞學和工程學原理對受損組織進行生理性修復，是一種理想的修復方法。由于其自身優(yōu)勢，骨髓間充質干細胞(mesenchymAlstem cells，MSCs)被認為是目前軟骨組織工程較理想的種子細胞，如何調控MSCs 定向分化成軟骨細胞是目前軟骨組織工程學中的重要問題。然而，MSCs 成軟骨分化的精確分子調控機制還未完全闡明，因此探求MSCs 成軟骨分化的調控機制，有可能為探索切實有效的促

2、分化策略提供基礎，同時也有益于推進組織工程軟骨在臨床的應用前景。近年一些研究證實，microRNA(miRNAs)在干細胞的干性維持和分化中具有重要的功能。與越來越復雜的基因網絡和蛋白網絡相比，miRNAs表達特征譜作為一種新的強有力的工具，在組織器官的定向發(fā)育、細胞生長和分化的時空調節(jié)、信號通路的開啟和關閉及疾病治療靶點確定的研究中更具獨特優(yōu)勢。探討miRNAs在MSCs 成軟骨分化中的作用機制，將為進一步理解MSCs 成軟骨分化的調

3、控網絡提供新的視角。
　　 本課題擬從三個部分的實驗研究對miRNAs 介導的調控MSCs 成軟骨分化的生物學功能及分子機制進行系統(tǒng)的探討。
　　 1.利用小鼠骨髓來源MSCs，建立穩(wěn)定的體外誘導成軟骨分化細胞模型。通過miRNA芯片技術獲得小鼠MSCs成軟骨分化不同階段的miRNA表達譜，并以定量PCR實驗對芯片結果進行驗證。再結合生物信息學預測軟件和定量PCR 實驗分析miRNA的靶基因，篩選出參與調控MSCs 成軟

4、骨分化的候選靶基因。
　　 2.結合生物信息學實驗和雙熒光素酶報告基因檢測，驗證候選miRNA作用于預測靶基因結合位點的真實性。
　　 3.利用C3H10T1/2 誘導成軟骨分化細胞模型，檢測針對候選miRNA的gain-of-function和loss-of-function 干預實驗中，各種軟骨特異性標志表型的表達變化，證實候選miRNA 調控MSCs 成軟骨分化的生物學效應。同時，以定量PCR和Westernblo

5、t 實驗探索候選miRNA 調節(jié)靶基因的作用機制。
　　 通過上述三部分實驗，研究結果顯示：1.通過直接貼壁法能夠獲得增殖能力強，MSCs 標志CD分子表型一致，并具備多向分化能力(成骨分化、成脂分化和成軟骨分化)的小鼠骨髓來源MSCs?；诖朔椒ǚ蛛x的MSCs，我們選取了MSCs 成軟骨分化不同階段的細胞進行miRNA 芯片掃描，包括：微團培養(yǎng)的P3 MSCs，MSCs 誘導成軟骨分化7d，MSCs 誘導成軟骨分化14d，單層

6、培養(yǎng)的原代軟骨細胞。結果在MSCs 成軟骨過程中，表達發(fā)生顯著性改變的miRNAs 有13個(8個上調，5個下調)。其中，miR-143/145和miR-132/212作為miRNA功能簇，在此進程中表達逐步下調。qPCR 驗證其中4個miRNAs的表達，與芯片結果一致，反映了芯片結果的可靠性。定量PCR 結果顯示，4個生物信息學預測差異表達的miRNAs的軟骨相關靶基因在此進程中的表達模式與相應的miRNA表達模式呈相反趨勢。提示這些

7、差異表達的miRNAs 可能參與調控MSCs 成軟骨分化。
　　 2.生物信息學預測，調控軟骨形成的關鍵轉錄因子Sox9及其協(xié)同效應分子RelA分別是miR-145和miR-143的靶基因。為了驗證其預測作用靶位點的真實性，我們分別成功構建了針對miR-145和miR-143的陽性對照熒光報告載體(pMIR-PT)，包含預測靶位點的實驗熒光報告載體(pMIR-MRE)和包含亂序排列的預測靶位點的實驗熒光報告載體(pMIR-MUT

8、)。雙熒光素酶報告基因證實，miR-145能與Sox9的3’-UTR上預測靶位點有效結合，發(fā)揮抑制效應。結合miRNA芯片結果顯示miR-145在誘導MSCs成軟骨分化中的顯著下調趨勢，進一步提示miR-145 有可能通過調節(jié)靶基因Sox9，參與調控MSCs 成軟骨分化進程。另一方面，miR-143的作用方式則不同于我們預期，我們僅得到了miR-143作用于RelA 預測靶位點的陰性結果，其在MSCs 成軟骨分化中的作用有待于獨立的實驗

9、再次探索。
　　 3.在C3H10T1/2 誘導成軟骨分化細胞模型中，miR-145 過表達能抑制Sox9下游靶基因，同時也是軟骨形成特征型表型基因(Col2a1、Agc1、COMP、Col9a2、Col11a1)的mRNA表達。相反，抑制miR-145表達則顯著促進上述基因mRNA表達。同時，miR-145 過表達能抑制細胞分泌軟骨特征型細胞外基質GAGs。相反，抑制miR-145表達則顯著提升GAGs 形成。另外，miR-1

10、45 僅在蛋白水平調節(jié)靶基因Sox9的表達。
　　 另一方面，無論過表達或抑制miR-145表達，均對Sox9下游非軟骨形成相關特異性靶基因(C/EBPδ、C/EBPβ)的mRNA表達沒有影響。進一步關于細胞增殖的實驗結果發(fā)現(xiàn)，miR-145的改變并未對細胞增殖產生影響。研究結果證實miR-145 調控MSCs成軟骨分化的作用效應，其作用機制是以轉錄后水平調節(jié)Sox9表達，從而特異性參與調控MSCs 成軟骨分化。
　　

11、綜上所述，本課題成功分離、培養(yǎng)小鼠骨髓來源MSCs，建立穩(wěn)定的體外誘導MSCs成軟骨分化的細胞模型。通過miRNA 芯片技術首次獲得小鼠MSCs 成軟骨分化4個不同階段的miRNA表達譜，并經定量PCR 驗證了部分結果；篩選出與軟骨形成相關候選miRNAs。驗證了miR-145作用于Sox9的3’-UTR靶位點的真實性。同時也證實了RelA 并非miR-143的靶基因。證實在TGF-β3 驅動的MSCs 成軟骨分化中，miR-145表達