乙腦病毒和西尼羅病毒單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、乙型腦炎病毒(Japaneseencephliticvirus,JEV)和西尼羅病毒(WestNileVirus,WNV)同屬于蟲媒病毒黃病毒科，黃病毒屬、乙型腦炎病毒抗原復(fù)合組(JapaneseEncephalitisVirusSerocomplexGroup)的成員。該復(fù)合組成員病毒屬于蚊媒病毒，主要由鳥類攜帶，經(jīng)蚊蟲傳播給人，也可以感染其它哺乳動物，引起多種臨床癥狀，包括發(fā)熱，甚至腦炎及腦膜炎，重者可致死。近年來，該組成員中的西尼

2、羅病毒流行已經(jīng)給人類的健康造成嚴重的損害和威脅。國外將西尼羅熱歸于新發(fā)傳染病(emerginginfectiousdisease)范疇，我國國家衛(wèi)生部將西尼羅熱歸于可能傳入的新發(fā)傳染病。早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防WNV的傳播是控制西尼羅熱爆發(fā)流行的主要措施，檢測蚊蟲體內(nèi)的WNV感染率是西尼羅病毒傳播預(yù)警的一個直觀指標。從人員和設(shè)備需求來看，快速免疫檢測方法具有明顯的優(yōu)勢。 黃病毒是正鏈RNA病毒。以西尼羅病毒為例，它由10962個核苷酸組成

3、，其開放讀碼框編碼病毒3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中包膜蛋白(E)和膜蛋白(M)是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，可能與病毒的毒力及侵襲性有關(guān)，也是病毒的主要抗原。但是，由于黃病毒屬成員間在病毒表面尤其是E蛋白上存在許多共同的抗原表位，所以在血清學(xué)檢測時容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，使反應(yīng)結(jié)果特異性不高。文獻報道，針對登革病毒M蛋白的前體prM蛋白的單克隆抗體與乙腦病毒抗血清無交叉反應(yīng)，提示在prM蛋白上可能存在病毒特異性抗原表位。為了探索高效、靈敏的檢測

4、WNV方法，本研究分別克隆了JEV和WNVprM基因，并原核表達，制備分別針對JEV和WNVprM蛋白的特異性單克隆抗體，用于JEV復(fù)合組成員感染的鑒定、鑒別診斷和流行病學(xué)研究。 首先，本研究采用JEV疫苗株免疫BALB/c小鼠，制備單克隆抗體，經(jīng)過五次亞克隆篩選，獲得分泌針對JEV疫苗株的單抗的雜交瘤細胞株V6B9，抗體亞型為IgG1，抗體滴度為105。ELISA、WesternBlot和免疫組化檢測結(jié)果證實該株單抗能夠與JE

5、V感染鼠腦上清中的病毒，以及與WNV反應(yīng)。該抗體可用于JEV復(fù)合組病毒的初步篩選。 同時，本研究采用RT-PCR方法，從人工接種感染JEV疫苗株(SA14-14-2株)的鼠腦中克隆編碼JEVprM蛋白的基因，將基因克隆入原核表達載體pET32a后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)LysS，以IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達后利用Ni-NTA進行純化。用純化的蛋白免疫BALB/c小鼠，經(jīng)ELISA法檢測表明，小鼠能夠產(chǎn)生針對重組西尼羅病毒p

6、rM的抗體。經(jīng)細胞融合和亞克隆后篩選出能分泌識別prM蛋白mAb的雜交瘤細胞株P(guān)1F2，抗體亞型為IgG1，抗體滴度為105。經(jīng)ELISA、WesternBlot和免疫組化檢測結(jié)果證實該株單抗能特異性地識別JEVprM蛋白和JEV疫苗株，并且與WNVprM蛋白無交叉反應(yīng)。 最后，參照GeneBank報道的WNV基因組序列，合成編碼prM基因，用同樣的方法將其克隆入原核表達載體并進行表達純化。將純化產(chǎn)物免疫小鼠制備單抗，獲得了能分

7、泌識別prM蛋白mAb的雜交瘤細胞株2株，抗體亞型為IgG1，抗體滴度為105～106。ELISA、WesternBlot檢測證實，所獲得的單抗能夠識別西尼羅病毒prM蛋白和WNV抗原，并與乙型腦炎病毒疫苗株無交叉反應(yīng)。以上兩種針對prM蛋白的單克隆抗體可用于乙型腦炎病毒組病毒的特異性檢測。 本研究所制備的抗JEV和抗WNV單克隆抗體，檢測方法具有特異、靈敏、快速的優(yōu)點，可為WNV和JEV的流行病學(xué)監(jiān)測，以及黃病毒組病毒感染的快