抗狂犬病病毒單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒引起的人畜共患的烈性傳染病,也是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病?？箍袢〔《締慰寺】贵w是研究狂犬病病毒診斷方法、治療及預(yù)防狂犬病的有力工具。為了獲得高效價(jià)、高特異性的抗狂犬病病毒的單克隆抗體,進(jìn)而將其應(yīng)用于開發(fā)一種方便、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、技術(shù)要求低且適合基層使用的診斷方法,本研究用人用狂犬疫苗免疫BALB/c小鼠,采用雜交瘤技術(shù)制備得到針對(duì)狂犬病病毒的穩(wěn)定的、效價(jià)高的、特異性強(qiáng)的單克隆抗體(mAb),并初步鑒定了雜交瘤

2、和mAb的生物學(xué)特性,包括:雜交瘤的染色體、雜交瘤分泌抗體的穩(wěn)定性、mAb的效價(jià)、亞類、純度、蛋白濃度以及mAb的特異性。為開發(fā)簡(jiǎn)單實(shí)用的檢測(cè)方法打下基礎(chǔ)。
　　 一、融合條件的摸索
　　 在充分了解SP2/0細(xì)胞系的生長(zhǎng)、增殖和遺傳特性后,以聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合,探索不同分子量、不同濃度的PEG作為融合劑對(duì)誘導(dǎo)SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞融合的最適條件。結(jié)果表明分子量為4000,濃度為50％的PEG誘導(dǎo)的細(xì)胞融

3、合率最高,為0.06429％,為下一步制備單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。
　　 二、單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備、篩選、克隆、穩(wěn)定性及染色體
　　 1.抗體制備與細(xì)胞融合
　　 使用人用狂犬疫苗免疫雌性BALB/c小鼠,間隔2周免疫1次。雙方陣法確定了間接ELISA法的最佳抗原包被濃度為1∶80,陽(yáng)性血清最適工作稀釋度為1∶400。間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到104的3d后,通過(guò)PEG4000使免疫B淋巴細(xì)胞和小鼠骨髓

4、瘤細(xì)胞SP2/0融合。融合3-5d后出現(xiàn)雜交瘤細(xì)胞,7-10d后觀察到雜交瘤細(xì)胞克隆生長(zhǎng)。經(jīng)HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)后,細(xì)胞的融合率為82.99％。
　　 2.陽(yáng)性克隆的篩選
　　 融合后14d左右,融合的雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)到大約培養(yǎng)板的1/2面積時(shí),按照已建立的間接ELISA法進(jìn)行篩選,陽(yáng)性克隆率為15.90％(38/239),選擇OD值比較高的14株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆。
　　 3.陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)

5、r>　　 用顯微操作法對(duì)陽(yáng)性克隆的細(xì)胞株,分別進(jìn)行了亞克隆,得到17珠分泌抗狂犬病病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名8F3、8F4、8G8、17A4、17A5、17A7、1782、1785、1784、17C2、17C6、17D2、17D4、17D8、17E3、17E4、17F3。選擇OD450值較高,生長(zhǎng)狀態(tài)良好的8F3、8F4、8G8、17B2、17E3、17E4、17F3進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和鑒定,其它株冷凍保存。
　　 4.

6、抗體分泌的穩(wěn)定性檢測(cè)
　　 將雜交瘤細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代,共傳18代每隔3代檢測(cè)一次細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體效價(jià),結(jié)果顯示6代以后雜交瘤進(jìn)入穩(wěn)定分泌抗體時(shí)期。
　　 5.雜交瘤細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù)
　　 雜交瘤細(xì)胞染色體的平均數(shù)為94條,符合融合細(xì)胞染色體的特點(diǎn)。
　　 三、單克隆抗體的制備及初步鑒定
　　 1.mAb的制備
　　 通過(guò)收集培養(yǎng)上清、體內(nèi)誘生腹水、制備實(shí)體瘤分離血清法獲得并保存了8F3、

7、8F4、8G8、17B2、17E3、17E4和17F3分泌的抗體。
　　 2.mAb的純化
　　 經(jīng)抗體亞類初步鑒定8F3、8F4、8G8、1782、17E3、17E4、17F3所分泌的抗體類型皆屬于IgG亞類,采用辛酸-硫酸銨法進(jìn)行純化。
　　 3.mAb的效價(jià)
　　 間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清、純化和未純化的腹水和實(shí)體瘤血清抗體效價(jià)。腹水和實(shí)體瘤血清中的抗體效價(jià)均高于104,最高的達(dá)1∶128000

8、,且腹水和實(shí)體瘤血清的效價(jià)比同種單抗細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價(jià)均高100倍以上。
　　 4.mAb的亞類
　　 Ig類及亞類的鑒定結(jié)果顯示8F3和8F4屬于IgG2b,8G8和17E4屬于IgG3、17B2屬于IgG1,17E3和17F3屬于IgG2a。
　　 5.mAb的純度
　　 純化后的單抗在50kD和25kD附近出現(xiàn)兩條帶,與預(yù)期的IgG抗體重鏈和輕鏈條帶大小相符,而未純化的單抗泳道上則出現(xiàn)多條雜帶。

9、r>　　 6.mAb的蛋白濃度
　　 紫外分光光度法測(cè)得17B2、17E3、17E4、17F3、8F3、8F4、8G8、濃度分別為:1.6565mg/mL、0.0162mg/mL、0.0163mg/mL、1.7120mg/mL、1.6315mg/mL、1.6834mg/mL、0.0163mg/mL。
　　 7.mAb的特異性
　　 7株單克隆抗體與三個(gè)廠家的狂犬疫苗反應(yīng)均為陽(yáng)性,與犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬傳染