埃博拉病毒GP蛋白單克隆抗體的篩選和制備.pdf

1、埃博拉病毒病是由埃博拉病毒感染引起的致死性出血熱。1976年首次在扎伊爾和蘇丹出現(xiàn)。截止2013年，共造成2387人發(fā)病，死亡1310例，病死率54.9％。2014年埃博拉病毒再次爆發(fā)，席卷西非，并跨越大洲，美國(guó)、英國(guó)、西班牙等相繼發(fā)生埃博拉病例。截止2015年12月8日，共發(fā)病28634例，死亡11314例，病死率仍高達(dá)39.5％。
　　從埃博拉首次爆發(fā)至今，已經(jīng)過(guò)去了將近40年，目前國(guó)際上仍然沒(méi)有特異的治療手段和可供臨床使用的

2、疫苗。埃博拉病毒病已經(jīng)成為國(guó)際性重大傳染病。及時(shí)有效的診斷能早期發(fā)現(xiàn)埃博拉病人，對(duì)病人進(jìn)行早期隔離，減少互相傳播，能有效控制疾病的蔓延。
　　埃博拉病毒病診斷依賴經(jīng)典的定量PCR技術(shù)，但該方法需要一定的設(shè)備和技術(shù)人員，并不能適用于全部地區(qū)?？焖佟㈧`敏、簡(jiǎn)易的免疫學(xué)診斷能及早發(fā)現(xiàn)病人，控制傳染源，對(duì)疫情防控至關(guān)重要，目前正缺乏這種免疫診斷產(chǎn)品。
　　埃博拉病毒病目前仍然沒(méi)有特效的治療方法。GP是埃博拉病毒感染入侵的主要蛋白，也

3、是診斷及治療的主要靶蛋白。國(guó)際上針對(duì)GP蛋白已經(jīng)研制出三種抗體混合的藥物ZMapp，但是治療效果仍然有限且不確切。因而埃博拉GP蛋白單克隆抗體的繼續(xù)開(kāi)發(fā)，為埃博拉病毒病治療提供更多的備選抗體，就能大大地增大治療埃博拉病毒病的可能性。
　　目的：
　　1)篩選和制備高效價(jià)的埃博拉GP蛋白單克隆抗體
　　2)驗(yàn)證單克隆抗體在ELISA，Western blot，細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。
　　3)完

4、成抗體的人源化
　　方法：
　　設(shè)計(jì)靶肽，篩選抗體表位，人工合成埃博拉GP蛋白多肽。用多肽配合博奧龍公司生產(chǎn)的細(xì)胞因子佐劑免疫小鼠，通過(guò)5周的免疫法，制備免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，采用細(xì)胞融合技術(shù)，與SP2O細(xì)胞融合，制備雜交瘤細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)和篩選，對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。
　　采用小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞制備埃博拉GP蛋白單克隆抗體，對(duì)抗體進(jìn)行純化和鑒定。完成單克隆抗體亞型鑒定，測(cè)序。完成抗體靈敏度和特異性檢測(cè)。用來(lái)自軍科

5、院的表達(dá)GP蛋白的假病毒構(gòu)建細(xì)胞模型。驗(yàn)證單克隆抗體在ELISA，Western blot，細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。
　　通過(guò)基因工程技術(shù)，對(duì)埃博拉GP蛋白單克隆抗體完成人源化改造。
　　結(jié)果：
　　1)篩選和制備了兩株高效價(jià)的埃博拉GP蛋白單克隆抗體ZJEB8-01，ZJED0-02。
　　2)ZJEB8-01，ZJED0-02檢測(cè)埃博拉GP蛋白的靈敏度達(dá)到1∶10000，該兩個(gè)抗體能運(yùn)用于

6、ELISA，Western blot，細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　　3)ZJEB8-01完成了人源化改造。
　　結(jié)論：
　　篩選和制備了埃博拉GP蛋白單克隆抗體ZJEB8-01，ZJED0-02。ZJEB8-01，ZJED0-02檢測(cè)埃博拉GP蛋白靈敏度達(dá)到1∶10000。該兩個(gè)抗體能運(yùn)用于ELISA，Western blot、細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫化學(xué)實(shí)驗(yàn)。ZJEB8-01人源化后，有望作為治療埃博拉