五種柑橘病害的RT-PCR及多重RT-PCR檢測研究.pdf

1、本研究于2004年7月至2006年4月在廣東省農(nóng)科院果樹研究所重點實驗室進行，以柑桔衰退病、碎葉病、裂皮病、黃龍病和潰瘍病為研究對象，建立了分別檢測這五種病害的RT-PCR體系，并探討了多重RT-PCR檢測方法，以期獲得快速、準確檢測柑桔病害的方法。獲得的主要研究結(jié)果如下： 1.建立了柑桔衰退病、碎葉病的RT-PCR檢測體系；并根據(jù)裂皮病為環(huán)狀類病毒，GC含量達到59.5﹪，通過選用特異Taq酶和添加PCR增強劑來提高PCR擴增

2、效率，建立了柑桔裂皮病的RT-PCR檢測體系。 2.首次RT-PCR檢測柑桔黃龍病和潰瘍病，并篩選出能在同一退火溫度下進行PCR擴增的各病害特異引物，實現(xiàn)了五種病害的同步化檢測。 3.在柑桔黃龍病和衰退病RT-PCR檢測體系的基礎上，建立了同時檢測這兩種病害的二重RT-PCR檢測體系。得出適合二重PCR體系的Taq酶濃度為0.05U/μl；dNTPs濃度為0.25mmol/L；Mg2+為1.5mmol/L；兩引物的濃度為

3、HLB0.30μmol/L、CTV0.15μmol/L；退火溫度為63℃。 4.首次以oligo(dT)引物為反轉(zhuǎn)錄，運用PCR檢測出具有ploy_(A)加尾的柑桔衰退病和碎葉病；發(fā)現(xiàn)不具有ploy_(A)加尾的柑桔裂皮病同樣可以用oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄的RT-PCR檢測出，通過測序分析，其同源性在96﹪以上，并發(fā)現(xiàn)在CEV序列中有一個富含A的區(qū)段。在此基礎上結(jié)合二重RT-PCR體系，進一步研究了同時檢測CTV、CEV和CTL