葡萄莖痘病毒原位RT-PCR檢測技術研究.pdf

1、上個世紀九十年代發(fā)展的原位PCR技術，結合了PCR和原位雜交的優(yōu)點，既可檢測出樣品中低拷貝的核酸，又可確定其細胞來源和細胞中的位置，至今已成為一項重要的形態(tài)學研究方法，利用原位RT-PCR檢測果樹病毒，對病毒在果樹各組織中的分布進行定位，可為果樹病毒檢測提供一種新的途徑，有助于我們了解病毒分布和傳輸的作用機制，對病毒的診斷、預防、治療等提供了新的實驗依據，也為果樹無毒化生產提供了理論依據，具有重要的理論價值和生產實踐意義。 本實

2、驗用常規(guī)RT-PCR檢測出攜帶葡萄莖痘病毒的葡萄樣本，采集此樣本和實生苗2 mm左右的莖尖組織，制成石蠟切片；用制備出的生物素標記的cDNA探針，在切片上進行直接原位RT-PCR和間接原位RT-PCR；通過觀測經過顯色系統檢測后的組織，確定葡萄莖痘病毒在莖尖中的分布情況。 本研究的主要內容和結論如下： 1．制備出適合植物莖尖幼嫩組織的石蠟切片，得到葡萄莖尖這種幼嫩且含水量大的植物組織最佳的脫水酒精梯度和時間：組織經4％多

3、聚甲醛固定1h，50％、70％、80％、90％、100％乙醇脫水各1h，適用于以莖尖為材料的原位RT-PCR。 2．用常規(guī)液相RT-PCR成功獲得長度為355bp的特異性片段。對特異性片段進行回收、連接、克隆，由上海生工進行測序。測序結果經BLAST(AF026278)比對，特異片段的同源性可達到89％。 3．利用克隆質粒，用PCR法制備出生物素標記cDNA探針，探針長度為355bp，并確定合適的探針濃度應用于原位RT-