豬瘟RT-PCR ELISA試劑盒的研制.pdf

1、本研究結(jié)合了標記地高辛的RT-PCR技術(shù)和生物素標記的探針雜交技術(shù)，成功建立了一種檢測豬瘟病原的RT-PCRELISA方法，組裝了試劑盒，并進行了初步應(yīng)用。 從5'-UTR(Un-translatedregion)區(qū)域設(shè)計了特異性的引物和捕獲探針，在PCR過程中加入了地高辛標記，將探針作生物素標記。利用鏈親和素包被的ELISA酶標板與生物素標記的探針特異性結(jié)合，而探針又特異性地與標記了地高辛的PCR產(chǎn)物相結(jié)合，最后采用抗地高辛的

2、辣根過氧化物酶與ABTS進行顯色。實驗過程中成功摸索了RT-PCRELISA過程的各項條件，確定了最佳的工作濃度與溫度以及反應(yīng)時間。本研究結(jié)果表明：鏈親和素的最佳包被濃度為1ug/ml，探針的最佳濃度為50ng/ml，PCR產(chǎn)物的濃度為每孔10ul，抗地高辛辣根過氧化物酶的稀釋濃度為1∶3000，最佳的雜交溫度為50℃，最佳的雜交時間為30-60分鐘。 對試劑盒內(nèi)試劑的保存作了防腐劑選擇實驗和保存期試驗，結(jié)果表明在試劑盒保存了1

3、0個月以后，陰陽性對照仍然成立。在防腐劑疊氮鈉和柳硫汞酸鈉的選擇實驗中發(fā)現(xiàn)疊氮鈉對酶有一定影響，大大降低了實驗OD值，因此選擇柳硫汞酸鈉作為試劑盒的防腐劑。采用本實驗建立的試劑盒對來自北京三個豬場50頭份病料進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有36頭份為陽性，14頭份為陰性。 本研究建立了一種快速、敏感、特異的豬瘟RT-PCRELISA方法，為我國豬瘟的診斷、監(jiān)測和調(diào)查提供了良好的新型技術(shù)手段，為保障北京市和我國的安全豬肉生產(chǎn)奠定了扎實的基礎(chǔ)