藻酸雙酯鈉在內(nèi)毒素性急性肺損傷和凝血功能障礙中的作用研究.pdf

1、目的:研究藻酸雙酯鈉對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和小鼠急性肺損傷模型的保護(hù)作用并探討其可能的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代，建立穩(wěn)定的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對象。對培養(yǎng)的PMVEC進(jìn)行 CD34細(xì)胞化學(xué)染色和植物凝集素（BSI）結(jié)合試驗(yàn)鑒定。
　　 2、采用MTT法檢測不同濃度的PSS對正常培養(yǎng)的PMVEC增殖的影響，以確定安全有效的實(shí)驗(yàn)用藥濃度。MTT法檢測PSS對LPS刺激P

2、MVEC的細(xì)胞活力的影響。
　　 3、將對數(shù)生長的PMVEC接種培養(yǎng)板上，隨機(jī)把細(xì)胞分為空白對照組（C組）、LPS刺激組（L組）、PSS+LPS組（LP組）。通過虎紅染色法測定測定PMN對PMVEC黏附數(shù)量。
　　 4、ELISA法檢測C組、L組、LP組培養(yǎng)上清液中TNF-α的濃度，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測各組ICAM-1的表達(dá)情況。
　　 5、應(yīng)用Western Blot 檢測C組、L組、LP組細(xì)胞磷酸化p38MA

3、PK和細(xì)胞核NF-κB p65的蛋白表達(dá)情況。
　　 6、應(yīng)用ELISA法檢測C組、L組、LP組培養(yǎng)上清液中PAI-1和t-PA濃度，應(yīng)用RT-PCR檢測PMVEC PAI-1和t-PA mRNA的表達(dá)。
　　 7、采用尾靜脈注射脂多糖復(fù)制小鼠急性肺損傷模型，將小鼠隨機(jī)分為四組：正常對照組（C組）、藻酸雙酯鈉對照組（P組）、脂多糖模型組（L組）、藻酸雙酯鈉+脂多糖組（LP組），每組10只小鼠。靜脈給藥8h后，收集靜脈血和

4、肺組織標(biāo)本。光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化并予病理評分，測定濕干重比值，ELISA法檢測肺組織勻漿TNF-α、ICAM-1濃度和血漿PAI-1、t-PA濃度，免疫組化檢測NF-κB p65的表達(dá)情況。另取20只小鼠隨機(jī)分為如上四組，8h后腹主動(dòng)脈取血用于PT、APTT、TT凝血指標(biāo)的檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1、復(fù)蘇后的PMVEC細(xì)胞呈梭形或多角形，呈典型“鋪路石”樣排列，CD34細(xì)胞化學(xué)染色和植物凝集素（BSI）結(jié)合試驗(yàn)

5、陽性。
　　 2、PSS在25-200μg·mL-1 濃度范圍內(nèi)對體外培養(yǎng)的PMVEC生長具有一定的增殖作用，如果大于400μg·mL-1 則對PMVEC的生長具有抑制作用。PSS能部分抑制LPS刺激PMVEC所導(dǎo)致的細(xì)胞活力下降。
　　 3、與C組比較，L組的PMVEC與PMN的黏附數(shù)明顯增加。與L組比較，PSS預(yù)處理一個(gè)小時(shí)，能減低LPS所致的PMVEC與PMN的黏附。
　　 4、結(jié)果顯示，與C組比較，L組T

6、NF-α和ICAM-1的表達(dá)明顯增加；與L組比較，LP組的TNF-α和ICAM-1表達(dá)明顯降低。
　　 5、Western Blot結(jié)果顯示：與C組比較，L組的PMVEC的磷酸化p38MAPK和胞核NF-κB p65的蛋白表達(dá)量明顯增高；與L組比較，LP組的蛋白表達(dá)量都明顯降低。
　　 6、結(jié)果顯示：與C組比較，L組PAI-1和t-PA濃度以及PAI-1 mRNA和t-PA mRNA表達(dá)量都顯著升高，PAI-1/t-PA

7、比值升高；與L組比較，LP組PAI-1濃度以及PAI-1 mRNA和t-PA mRNA表達(dá)量都降低，PAI-1/t-PA比值明顯減低。
　　 7、與C組比較，L組小鼠W/D比值增大，肺組織表達(dá)TNF-α和ICAM-1增高，血漿PAI-1和t-PA濃度增加，PAI-1/t-PA比值增大，肺組織NF-κB p65染色增強(qiáng)，胞核染色增多，IOD值增高；P組小鼠的上述指標(biāo)與C組比較無顯著差異；LP組小鼠與L組比較上述指標(biāo)都顯著降低。凝血

8、指標(biāo)方面，與C組比較，P組小鼠APTT和TT顯著延長，L組PT、APTT和TT明顯縮短；與L組比較，LP組小鼠PT、APTT和TT都有延長。
　　 結(jié)論:
　　 1、適當(dāng)濃度的PSS能對體外培養(yǎng)的PMVEC生長具有一定的增殖作用，濃度過高則對PMVEC的生長具有抑制作用。LPS能對體外培養(yǎng)的PMVEC造成損傷，而PSS能抑制這種損傷，起到保護(hù)PMVEC的作用。
　　 2、PSS能抑制LPS誘導(dǎo)的PMVEC與PMN

9、之間的黏附。
　　 3、PSS能抑制LPS誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和TNF-α的表達(dá)。
　　 4、PSS能抑制LPS對PMVEC的p38MAPK和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，對p38MAPK的抑制作用強(qiáng)于對NF-κB的抑制作用。
　　 5、PSS能通過降低PAI-1mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，減低LPS對PMVEC纖溶的抑制作用。
　　 6、PSS對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與